位置
空氣通過前麵開口進入生物安全櫃的速度大約為0.45 m/s。這樣速度的定向氣流是極易受到幹擾的，包括人員走近生物安全櫃所形成的氣流、打開窗戶、送風係統調整以及開關門等都可能造成影響。因此，最為理想的是，生物安全櫃應位於遠離人員活動、物品流動以及可能會擾亂氣流的地方。在安全櫃的後方以及每一個側麵要盡可能留有30 cm的空間，以利於對安全櫃的維護。在安全櫃的上麵應留有30～35 cm的空間，以便準確測量空氣通過排風過濾器的速度，並便於排風過濾器的更換。
操作者
生物安全櫃如果使用不當，其防護作用就可能大大受到影響。操作者在移動雙臂進出安全櫃時，需要小心維持前麵開口處氣流的完整性，雙臂應該垂直地緩慢進出前麵的開口。手和雙臂伸入到生物安全櫃中等待大約一分鍾，以使安全櫃調整完畢並且讓裏麵的空氣“掃過”手和雙臂的表麵以後，才可以開始對物品進行處理。要在開始實驗之前將所有必需的物品置於安全櫃內，以盡可能減少雙臂進出前麵開口的次數。
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