3．3％鹽酸酒精；
染色的第一步是製作塗片。菌液塗片時，用接種環沾取菌液點在載玻片上，標本可直接在玻片上塗布。菌落塗片時，先取生理鹽水 1滴，置玻片上，用接種針挑取菌落，在鹽水中塗布。塗片時必須注意應輕輕操作。猛烈的動作會改變菌細胞原有的排列形式，或造成細菌鞭毛脫落，影響結果的準確性。製備的塗片應自然幹燥，並經火焰固定，固定溫度不宜過高，以玻片背麵接觸手背不燙為準，否則可能使細胞形態改變。將固定後的塗片進行染色。
一、革蘭染色
本染色是最基本的染色法，可用於標本塗片或菌落塗片。染色結果將細菌分為革蘭陽性(紫色)和革蘭陰性(紅色)兩類。
試劑
1. 結晶紫溶液
A液： 結晶紫 2g
95％乙醇 20ml
B液： 草酸銨 0.8g
蒸餾水 80ml
需在用前24h將A液、B液混合，過濾後裝入試劑瓶內備用。
2．碘液
碘 1g
碘化鉀 2g
蒸餾水 300ml
碘與碘化鉀混合並研磨，加入幾毫升水，使其逐漸溶解，然後研磨，繼續加入少量蒸餾水至完全溶解。最後補足水量。
也可用少量蒸餾水，先將碘化鉀完全溶解，再加入碘片，待完全溶解後，加水至300ml。
3．脫色液：95％乙醇。
4．複染液
A. 貯存液： 沙黃 2.5g
95％乙醇 100ml
B. 應用液： A液 10ml
蒸餾水 90ml
染色方法：
1．塗片經火焰固定，加結晶紫液染1 min，清水衝去染液。
2．加碘液染l min，水洗。
3．加脫色液，不時搖動約10～30s，至無紫色脫落為止，水洗。
4．加複染液，染30s，水洗。
5．幹後鏡檢。
二、抗酸染色
抗酸染色直接用於痰標本時，可以適當增加標本塗片的厚度，以提高檢出率。染厚塗片時，須掌握複染色時間。如果背景過深，影響鏡檢。
奴卡菌及放線菌可呈弱抗酸性，取培養菌落塗片染色時，呈現兩種現象，視野中有些菌細胞陽性，另外一些則陰性；有時同一個菌體上，紅色的深淺亦有不同，觀察時應予注意。
抗酸染色有兩種常用方法：① 堿性複紅法又稱萋納(Ziehl—Neelsen)法。 ② 熒光染料金胺O法(也稱金胺O-羅丹明B法)。
(一) 堿性複紅染色法
試 劑
1．萋納石炭酸複紅溶液
堿性複紅乙醇飽和溶液 10ml
5％石炭酸溶液 90ml
2．脫色劑 *
濃鹽酸 3ml
95％乙醇 97ml
3．複染液(呂弗勒美藍液)
美藍乙醇飽和溶液 30ml
10％氫氧化鉀 0.1ml
蒸餾水 100ml
染色方法
1．塗片經火焰固定，加石炭酸複紅溶液，徐徐加熱至有蒸汽出現，切不可沸騰。染5 min(若染色奴卡菌需要加長時間)，水洗。
2．加脫色劑，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗。
3．加複染液，染0.5～l min，
