細菌檢驗工作的基本技術——葡萄球菌屬

注： a．葡萄球菌屬、動性球菌屬、口腔球菌屬、微球菌屬皆隸於微球菌科。

b．符號：+，90％以上陽性；土，90％以上弱陽性；一，90％以上陰性；d，1l％一89％陽性；ND，未試驗；(   ) 遲緩反應。

c．在某些菌種中出現觸酶弱陽性或假陽性反應，是由於在培養中補充血紅素，活化某些菌株觸酶活性。

d．Faller和Schleifer改良氧化酶試驗為檢出細胞色素C。

e．標準的氧化—發酵試驗。

f．+，耐藥或無抑菌環，微球菌、口腔球菌、氣球菌敏感，抑菌環10～25mm。

g．十，耐藥或抑菌環≤9mm；一，敏感，抑菌環15～35mm。

h．表皮葡萄球菌有些菌株生長時緊固地粘附於瓊脂表麵，此種特性與細菌產生濃的粘液相關。

 

1．與鏈球菌鑒別：葡萄球菌與鏈球菌的區別如下：在鏡下，葡萄球菌以單、雙、葡萄狀排列，菌體呈圓形。鏈球菌以成單、雙、鏈狀排列，菌體形態為圓形或橢圓形。葡萄球菌觸酶試驗陽性，鏈球菌則陰性。

2．與微球菌的鑒別：實驗室常用的鑒別依據是形態和發酵葡萄糖產酸。在鏡下，葡萄球菌以葡萄狀排列為主，菌體較小；微球菌以四聯排列為主，且菌體較大。葡萄球菌發酵葡萄糖產酸試驗陽性，微球菌陰性。此外杆菌肽、呋喃唑酮敏感試驗有利區別兩屬菌種。

目前葡萄球菌已被命名有27個種。臨床標本中最常見有意義菌種是金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、裏昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中間葡萄球菌和豬葡萄球菌。首先用凝固酶試驗將其分為凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌(包括中間和豬葡萄球菌)和凝固酶陰性的其他葡萄球菌，然後用新生黴素敏感試驗。推斷新生黴素耐藥為腐生葡萄球菌。下表列出了關鍵鑒定試驗來區別上述8個菌。

試劑：3％H₂O₂溶液，置棕色瓶內於4℃陰暗處保存。

方法：先挑取固體培養基上的菌落，置於潔淨的玻片上，然後滴加3％過氧化氫溶液1～2滴。靜置之，lmin內產生大量氣泡的為陽性，不產生氣泡的為陰性。

 

 表             有臨床意義的8種葡萄球菌關鍵性鑒定

 

注意點：       1．注意過氧化氫為3％，應用30％濃的H₂O₂，用時稀釋10倍。

      2．不應在培養基上做試驗。

      3．每次試驗時，應以陽性和陰性菌株做對照。

 

葡萄球菌凝固酶試驗被廣泛地用於常規鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。試管法凝固酶試驗稱為葡萄球菌凝固酶，玻片法為檢測凝聚因子。

1．凝聚因子試驗：取1滴蒸餾水於潔淨的玻片上，用接種環挑取待檢菌一環置於蒸餾水中，製成濃的菌懸液，無自凝現象。然後加一環家兔血漿混合，10s內觀察結果，出現明顯細菌凝塊為陽性，否則為陰性。如超過 10s可出現假陽性，有10％一15％金黃色葡萄球菌呈假陰性，因此必須用試管法驗證凝聚因子試驗。

操作過程中的注意點：

(1)    10s內觀察結果。

(2)    必須製備濃厚的均勻菌懸液。

(3)    用EDTA抗凝的兔血漿為最好。

(4)    加血漿後不要再混攪，以免細菌凝塊分散變小。

(5)    生長在高鹽培養基上的菌落可出現自凝或假陽性。

2．葡萄球菌凝固酶試驗：用生理鹽水將血漿4倍稀釋，取0.5ml。然後挑取3～5個菌落於稀釋血漿中，成濃菌懸液。置37℃水浴，3～4h後讀取結果，凝固者為陽性。若陰性，繼續觀察到24h，不凝固者為陰性。試驗應同時作陽性、陰性對照。

試管法葡萄球菌凝固酶試驗陽性者，應見到明顯的纖維蛋白凝膠塊，出現羊毛狀或纖維狀沉澱物並非真正凝固，應判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌需要較長時間孵育，才可出現陽性。凝固酶試驗應考慮下述情況：

①     某些金黃色葡萄球菌產生溶纖維蛋白酶，溶解纖維蛋白凝塊。

②     所用血漿缺乏纖維蛋白原。

③     試驗菌株不純。

 

葡萄球菌的OF試驗應使用專用配方，不可與非發酵菌用的OF管混用。培養基用的指示劑必須用水配製，因為個別菌株能分解乙醇產酸。

培養基：

    酵母浸膏                        0.1g

    胰腖                               1g

    牛肉浸液                        l00ml

    0.2％溴甲酚紫溶液         lml

校正pH7.0，按常規方法加入1％的碳水化合物，分裝，滅菌，備用。

溴甲酚紫的配製：溴甲酚紫lOOmg， 0.01mol的NaOH 18.5ml，加水至50ml。

方法：挑取待檢菌落，接種於2支O-F培養基管中，發酵管加滅菌液體石蠟油約 lcm深，氧化管不加。35℃孵育24h後觀察，培養基變黃即產酸。結果判定如下：

 

 

方法：挑取待檢菌菌落數個，製成相當 0.5號麥氏管(McFarland)濃度菌液，棉拭子浸透，擠去多餘液，均勻塗在M—H平板上，貼上含5ug／片的新生黴素紙片，35℃孵育 16～20h，抑菌環直徑≤16mm為陽性(耐藥)。試驗時應以金黃色葡萄球菌 ATCC25923做陰性(敏感)對照，以確認紙片是否有效。

 

試劑：

四甲基對苯二胺 (TMPD)  (Tetramethylphenylenediamine)    6.0g

二甲基亞碸 (DMSO)      (Dimethy sulfoxide)                    100.0ml

溶解TMPD於DMSO中，置於避光玻塞瓶中，可在室溫中保留幾個星期。

方法：被檢菌株移種於7％羊血瓊脂上，30℃需氧條件下孵育15～18h，刮取菌落塗布於無色濾紙片上，加1滴上述試劑，陽性者在2min內呈深藍色。

若被測菌株移種在蛋白腖酵母浸出液瓊脂上，至少孵育3天以上，才可檢測，陽性反應5～10min出現。