藥品微生物實驗室規範指導原則

     藥品微生物實驗室規範指導原則用於指導藥品微生物檢驗實驗室的質量控製。

     藥品微生物的檢驗結果受很多因素的影響，如樣品中微生物可能分布不均勻、微生物檢驗方法的誤差較大等。因此，在藥品微生物檢驗中，為保證檢驗結果的可靠性，必須使用經驗證的檢測方法並嚴格按照藥品微生物實驗室規範要求進行試驗。

     藥品微生物實驗室規範包括以下幾個方麵：人員、培養基、菌種、實驗室的布局和運行、設備、文件、實驗記錄、結果的判斷等。

      從事藥品微生物試驗工作的人員應具備微生物學或相近專業知識的教育背景。

      實驗人員應依據所在崗位和職責接受相應的培訓，在確認他們可以承擔某一試驗前，他們不能獨立從事該項微生物試驗。應保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必需的設備操作、微生物檢驗技術和實驗室生物安全等方麵的培訓，經考核合格後方可上崗，同時，實驗室應製定所有級別實驗人員的繼續教育計劃。

     檢驗人員必須熟悉相關檢測方法、程序、檢測目的和結果評價。微生物實驗室的管理者其專業技能和經驗水平應與他們的職責範圍相符，如：管理技能、實驗室安全、試驗安排、預算、實驗研究、實驗結果的評估和數據偏差的調查、技術報告書寫等。

     實驗室應通過參加內部質量控製、能力驗證或使用標準菌株等方法客觀評估檢驗人員的能力，必要時對其進行再培訓並重新評估。當使用一種非經常使用的方法或技術時，有必要在檢測前確認微生物檢測人員的操作技能。

      所有人員的培訓、考核內容和結果均應記錄歸檔。

      培養基是微生物試驗的基礎，直接影響微生物試驗結果。適宜的培養基製備方法、貯藏條件和質量控製試驗是提供優質培養基的保證。

      培養基可按處方配製，也可使用按處方生產的符合規定的脫水培養基。

      在製備培養基時，應選擇質量符合要求的脫水培養基或單獨配方組分進行配製。脫水培養基應附有處方和使用說明，配製時應按使用說明上的要求操作以確保培養基的質量符合要求，不得使用結塊或顏色發生改變的脫水培養基。脫水培養基或單獨配方組分應在適當的條件下貯藏，如低溫、幹燥和避光，所有的容器應密封，尤其是盛放脫水培養基的容器。商品化的成品培養基除了應附有處方和使用說明外，還應注明有效期、貯藏條件、適用性檢查試驗的質控菌和用途。

      為保證培養基質量的穩定可靠，各脫水培養基或各配方組分應準確稱量，並要求有一定的精確度。配製培養基最常用的溶劑是純化水，特殊情況下，可能需要用去離子水和蒸餾水。應記錄各稱量物的重量和水的使用量。

      配製培養基所用容器和配套器具應潔淨，可用純化水衝洗玻璃器皿以消除清潔劑和外來物質的殘留，對熱敏感的培養基如糖發酵培養基其分裝容器一般應預先進行滅菌，以保證培養基的無菌性。

      脫水培養基應完全溶解於水中，再行分裝與滅菌。配製時若需要加熱助溶，應注意不要過度加熱，以避免培養基顏色變深。如需要添加其他組分時，加入後應充分混勻。應按照生產商提供或使用者驗證的參數進行培養基的滅菌。商品化的成品培養基必須附有所用滅菌方法的資料。培養基滅菌一般采用濕熱滅菌技術，特殊培養基可采用薄膜過濾除菌。

      培養基若采用不適當的加熱和滅菌條件，有可能引起顏色變化、透明度降低、瓊脂凝固力或pH 的改變。因此，培養基應采用驗證的滅菌程序滅菌，培養基滅菌方法和條件，應通過無菌性試驗和促生長試驗進行驗證。此外，對高壓滅菌器的蒸汽循環係統也要加以驗證，以保證在一定裝載方式下的正常熱分布。溫度緩慢上升的高壓滅菌器可能導致培養基的過熱，過度滅菌可能會破壞絕大多數的細菌和真菌培養基促生長的質量。滅菌器中培養基的容積和裝載方式也將影響加熱的速度。因此，應根據滅菌培養基的特性，進行全麵的滅菌程序驗證。

      應確定每批培養基滅菌後的pH值（冷卻至室溫25 ℃ 測定）。若培養基處方中未列出pH 值的範圍，除非經驗證表明培養基的pH 值允許的變化範圍很寬，否則，pH值的範圍不能超過規定值士0.2 。

      製成平板或分裝於試管的培養基應進行下列檢查：容器和蓋子不得破裂，裝量應相同，盡量避免形成氣泡，固體培養基表麵不得產生裂縫或漣漪，在冷藏溫度下不得形成結晶，不得汙染微生物等。應檢查和記錄批數量、有效期及培養基的無菌檢查。

自配的培養基應標記名稱、批號、配製日期等信息，並在已驗證的條件下貯藏。商品化的成品培養基標簽上應標有名稱、批號、生產日期、失效期及培養基的有關特性，生產商和使用者應根據培養基使用說明書上的要求進行貯藏，所采用的貯藏和運輸條件應使成品培養基最低限度的失去水分並提供機械保護。

      培養基滅菌後若貯藏在高壓滅菌器中，質量可能會受影響，一般不提倡這種存放法。瓊脂培養基不得在O ℃ 或O ℃ 以下存放，因為冷凍可能破壞凝膠特性。培養基應避光保存，若要長期保存，應置於密閉容器中以防止水分流失。瓊脂平板最好現配現用，如置冰箱保存，一般不超過1周，且應密閉包裝，若延長保存期限，保存期需經驗證確定。

      固體培養基滅菌後的再融化隻允許1 次，以避免因過度受熱造成培養基質量下降或微生物汙染。培養基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加熱。若使用微波爐，應避免培養基過度受熱及水分的蒸發，更要注意安全。融化的培養基應置於45 ～50 ℃ 的水浴中，不得超過8 小時。傾注培養基時， 應擦幹培養基容器外表麵的水分，避免容器外壁的水滴進人培養基中造成汙染。

      使用過的培養基（包括失效的培養基）應按照國家汙染廢物處理相關規定進行。

      實驗室應對試驗用培養基建立質量控製程序，以確保所用培養基質量符合相關檢測的需要。

      實驗室配製或商品化的成品培養基的質量依賴於其製備過程，采用不適宜方法製備的培養基將影響微生物的生長或複蘇，從而影響試驗結果的可靠性。

      所有配製好的培養基均應進行質量控製試驗。實驗室配製的培養基的常規監控項目是pH 、適用性檢查試驗，定期的穩定性檢查以確定有效期。培養基在有效期內應依據適用性檢查試驗確定培養基質量是否符合要求。有效期的長短將取決於在一定存放條件下（包括容器特性及密封性）的培養基其組成成分的穩定性。

      除藥典附錄另有規定外，在實驗室中，若采用已驗證的配製和滅菌程序製備培養基且過程受控，那麽同一批脫水培養基的適用性檢查試驗可隻進行1 次。如果培養基的製備過程未經驗證，那麽每一批培養基均要進行適用性檢查試驗，試驗的菌種可根據培養基的用途從相關附錄中進行選擇，也可增加從生產環境及產品中常見的汙染菌株。

      培養基的質屋控製試驗若不符合規定，應尋找不合格的原因，以防止問題重複出現。任何不符合要求的培養基均不能使用。

      用於環境監控的培養基須特別防護，最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養基，那麽在使用前應進行100 ％的預培養以防止外來的汙染物帶到環境中及避免出現假陽性結果。

      試驗過程中，生物樣本可能是最敏感的，因為它們的活性和特性依賴於合適的試驗操作和貯藏條件。實驗室菌種的處理和保藏的程序應標準化，使盡可能減少菌種汙染和生長特性的改變。按統一操作程序製備的菌株是微生物試驗結果一致性的重要保證。

      藥品微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的商業派生菌株。

      標準菌株的複活或培養物的製備應按供應商提供的說明或按已驗證的方法進行。從國內或國外菌種保藏機構獲得的標準菌株經過複活並在適宜的培養基中生長後，即為標準儲備菌株。標準儲備菌株應進行純度和特性確認。標準儲備菌株保存時，可將培養物等份懸浮於抗冷凍的培養基中，並分裝於小瓶中，建議采用低溫冷凍幹燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低於-30 ℃ ）等方法保存。低於-70 ℃ 或低溫冷凍幹燥方法可以延長菌種保存時間。標準儲備菌株可用於製備每月或每周1 次轉種的工作菌株。冷凍菌種一旦解凍轉種製備工作菌株後，不得重新冷凍和再次使用。

       工作菌株的傳代次數應嚴格控製，不得超過5 代（從菌種保藏機構獲得的標準菌株為第0代），以防止過度的傳代增加菌種變異的風險。1 代是指將活的培養物接種到微生物生長的新鮮培養基中培養，任何亞培養的形式均被認為是轉種或傳代1 次。必要時，實驗室應對工作菌株的特性和純度進行確認。

       工作菌株不可替代標準菌株，標準菌株的商業衍生物僅可用作工作菌株。

       實驗室必須建立和保存其所有菌種的進出、收集、貯藏、確認試驗以及銷毀的記錄，應有菌種管理的程序文件（從標準菌株到工作菌株），該程序包括：標準菌種的申購記錄；從標準菌株到工作菌株操作及記錄，菌種必須定期轉種傳代，並做純度、特性等實驗室所需關鍵指標的確認，並記錄；每支菌種都應注明其名稱、標準號、接種日期、傳代數；菌種生長的培養基和培養條件；菌種保藏的位置和條件；其他需要的程序。

      實驗室應具有進行微生物檢測所需的適宜、充分的設施條件。實驗室的布局與設計應充分考慮到良好微生物實驗室操作規範和實驗室安全的要求。實驗室布局設計的基本原則是既要最大可能防止微生物的汙染，又要防止檢驗過程對環境和人員造成危害。活動區域的合理規劃及區分將提高微生物實驗室操作的可靠性。

      通常，實驗室應劃分成相應的潔淨區域和活菌操作區域，同時應根據試驗目的，在時間或空間上有效分隔不相容的試驗活動，將交叉汙染的風險降低到最低。

      一般情況下，藥品微生物檢驗的實驗室應有符合無菌檢查法（附錄XI H ）和微生物限度檢查法（附錄XI J ）要求的、用於具有開展無菌檢查、微生物限度檢查、無菌采樣等檢測活動的、獨立設置的潔淨室（區）或隔離係統，並為上述檢驗配備相應的陽性菌實驗室、培養室、試驗結果觀察區、培養基及實驗用具準備（包括滅菌）區、樣品接收和貯藏區、標準菌株貯藏區、汙染物處理區和文檔處理區等輔助區域，同時，應對上述區域明確標識。

      實驗室應對進出潔淨區域的人和物建立控製程序和標準操作規程，應按相關國家標準建立潔淨室（區）和隔離係統的驗證、使用和清潔維護標準操作規程，對可能影響檢測結果的工作（如潔淨度驗證及監測、消毒、清潔維護等）能夠有效地控製、監測並記錄。

       實驗室對所用的消毒劑種類應定期更換，使用的消毒劑應無菌。

      若需要進一步分析培養物的特性，如再培養、染色、微生物鑒定或其他確定試驗均應在實驗室的活菌操作區進行。任何出現微生物生長的培養物不得在實驗室無菌區域內打開。對染菌的樣品及培養物應有效隔離以減少假陽性結果的出現。

      不能在實驗室的活菌操作區域或鄰近區域進行抽樣。采樣時，應采用無菌操作技術進行取樣，防止在取樣過程中使樣品受到微生物的汙染而導致假陽性的結果。因此，實驗設施應設計成保證樣品在控製條件下抽樣，包括能有效防止微生物汙染的無菌設施及環境、適宜的無菌服、無菌抽樣器具和合格的操作人員，並記錄抽樣環境的監測結果。如果可能，所有的樣品應在具有無菌條件的特定抽樣間進行無菌抽樣。

      被檢樣品應有傳遞、貯藏、處置和識別管理程序。待驗樣品應在合適的條件下貯藏並能夠保證其完整性而不改變其性狀，應明確規定和記錄貯藏條件。

實驗室應有妥善處理廢棄樣品和有害廢棄物的設施和製度，還應針對類似於帶菌培養物溢出的意外事件製定處理規程，如：活的培養物灑出必須就地處理，不得使培養物汙染擴散。

      實驗室應配備與檢驗能力和工作量相適應的儀器設備，其類型、測量範圍和準確度等級應滿足檢驗所采用標準的要求，設備的安裝和布局應便於操作，易於維護、清潔和校準。

      實驗室在儀器設備完成相應的檢定、校準、驗證、確認其性能，並形成相應的操作、維護和保養的標準操作規程後方可正式使用，使用要有記錄。為保證設備處於良好工作狀態，應定期維護和期間核查，並保存相關記錄。

      微生物實驗室所用的儀器應根據日常使用的情況進行定期的校準，並記錄。校準的周期和校驗的內容根據儀器的類型和設備在實驗室產生的數據的重要性的不同而不同。重要的儀器設備，如培養箱、冰箱等，應由專人負責，保證其運行狀態正常和受控，同時應有相應的備用設備以保證試驗菌株和微生物培養的連續性；對於培養箱、冰箱、高壓滅菌鍋等影響實驗準確性的關鍵設備應在其運行過程中對關鍵參數（如溫度、壓力）進行連續觀測和記錄，有條件的情況下盡量使用自動記錄裝置。如果發生偏差，應評估對以前的檢測結果造成的影響並采取必要的糾正措施。

      對於一些容易汙染微生物的儀器設備如水浴鍋、培養箱、冰箱和生物安全櫃等應定期進行清潔和消毒。

      對試驗需用的無菌器具應實施正確的清洗、滅菌措施，並形成相應的標準操作規程，無菌器具應有明確標識並與非無菌器具加以區別。

      文件應當充分表明試驗是在實驗室裏按可控的檢查法進行的，一般包括以下方麵：人員培訓與資格確認；設備驗收、驗證、檢定（或校準期間核查）和維修；設備使用中的運行狀態（設備的關鍵參數）；培養基製備、貯藏和質量控製；檢驗規程中的關鍵步驟；數據記錄與結果計算的確認；質量責任人對試驗報告的評估；數據偏離的調查。

     實驗結果的可靠性依賴於試驗嚴格按照標準操作規程進行，而標準操作規程應指出如何進行正確的試驗操作。實驗記錄應包含所有關鍵的實驗細節，以便確認數據的完整性。

      實驗室原始記錄至少應包括以下內容：實驗日期、檢品名稱、實驗人員姓名、標準操作規程編號或方法、實驗結果、偏差（存在時）、實驗參數（所使用的設備、菌種、培養基和批號以及培養溫度等）、主管／複核人簽名。

      試驗所用的每一個關鍵的實驗設備均應記錄在案，任何恰當的日常記錄都是有用的。應設計合適的設備日誌或表格，以滿足試驗記錄的追蹤性，設備溫度（水浴、培養箱、滅菌器）必須記錄，且具有追溯性。

      實驗記錄寫錯時，用單線劃掉並簽字。原來的數據不能抹去或被覆蓋。

所有實驗室記錄應以文件形式保存並防止意外遺失，正規的記錄應存放在特定的地方並有登記。

      由於微生物試驗的特殊性，在實驗結果分析時，應從各個可能的方麵去考慮，不但要假設被汙染，而且要考慮微生物在原料、輔料或試驗環境中存活的可能性。此外，還應考慮微生物的生長特性。

      對實驗結果應進行充分和全麵的評價。所有影響結果觀察的微生物條件和因素應完全考慮，包括與規定的限度或標準有很大偏差的結果。關鍵是應知道實驗結果與標準的差別是否有統計學意義。

若發現實驗結果不符合藥典各品種項下要求或另外建立的質量標準，應進行原因調查。引起微生物汙染結果不符合標準的原因主要有兩個：試驗操作錯誤或產生無效結果的試驗環境條件；產品本身的微生物汙染總數超過規定的限度或檢出控製菌。

       異常結果分析時，應考慮實驗室環境、抽樣區的防護條件、樣品在該檢驗條件下以往檢驗的情況、樣品本身具有使微生物存活或繁殖的特性等情況。此外，回顧試驗過程，也可評價該實驗結果的可靠性及實驗過程是否恰當。如果試驗操作被確認是引起實驗結果不符合的原因，那麽應製定改錯方案以解決問題，按照正確的操作方案進行實驗，在這種情況下，對試驗過程及試驗操作應特別認真地進行監控。

     如果依據分析調查結果發現試驗有錯誤而判實驗結果無效，那麽這種情況必須記錄。實驗室也必須認可複試程序，如果需要，可按相關規定重新抽樣，但抽樣方法不能影響不符合規定結果的分析調查。