無菌檢查法

      無菌檢查法係用於檢查藥典要求無菌的生物製品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發現微生物汙染。

      無菌檢查應在環境潔淨度10000 級下的局部潔淨度100級的單向流空氣區域內或隔離係統中進行，其全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物汙染，防止汙染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區、工作台麵及環境應定期按《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮遊菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔淨度驗證。隔離係統應按相關的要求進行驗證，其內部環境的潔淨度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環境進行監控。

       無菌檢查人員必須具備微生物專業知識，並經過無菌技術的培訓。

      培養基的製備  培養基可按以下處方製備，亦可使用按該處方生產的符合規定的脫水培養基。配製後應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。製備好的培養基應保存在2 一25 ℃ 避光的環境，若保存於非密閉容器中，一般可在3 周內使用；若保存於密閉容器中，一般可在1 年內使用。

      1 ．硫乙醇酸鹽流體培養基
     酪腖（胰酶水解）15.0g        酵母浸出粉5.0g

     葡萄糖5.0g                         氯化鈉2.5g

     L-胱氨酸0.5g                      新配製的1 . Oml 0.1％刃天青溶液

     硫乙醇酸鈉0.5g                   瓊脂0.75g

    （或硫乙醇酸）(0.3ml）        水1000ml

     除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調pH 值為弱堿性，煮沸，濾清，加人葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調pH 值使滅菌後為7.1士0.2 。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束後培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的1/2 , 滅菌．在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/5 ，否則，須經100℃ 水浴加熱至粉紅色消失（不超過20 分鍾）後，迅速冷卻，隻限加熱1次，並防止被汙染。

     2 ．改良馬丁培養基
     腖5.0g                  磷酸氫二鉀1.0g

     酵母浸出粉2.0g      硫酸鎂0.5g

     葡萄糖20.0g          水l000ml

    除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調pH 值約為6.8 ，煮沸；加人葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調pH值使滅菌後為6.4士0.2 ，分裝，滅菌。

     按上述硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基的處方及製法，在培養基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表麵活性劑，其用量同方法驗證試驗。

     腖10.0g                     氯化鈉5.0g

     牛肉浸出粉3.0g           水1000ml

    取上述成分混合，微溫溶解，調pH 值為弱堿性，煮沸，濾清，調pH 值使滅菌後為7.2士0.2 ，分裝，滅菌。

      按上述營養肉湯培養基的處方及製法，加人14.0g瓊脂，調pH 值使滅菌後為7.2 士0.2馬丁培養基的處方及製法，加人14.0g瓊脂，調pH 值使滅菌後為6.4士0.2，分裝，滅菌．培養基的適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基應符合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。

      培養基的無菌性檢查   每批培養基隨機抽取不少於10 支（瓶）, 5 支（瓶）置30～35℃，另5支（瓶）置20～25 ℃ 培養14 天，均應無菌生長。

 

      菌種  培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的冷凍幹燥菌種為第O 代），試驗用菌種應采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性．

      金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC (B) 26003］

      銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) [ CMCC (B) 10104］

      枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) [CMCC (B) 63501]

      生孢梭菌（Clostridium  sporogenes）[ CMCC ( B )64941]

      白色念珠菌（Candida  albicans) [ CMCC ( F) 9800l］

      黑曲黴（Aspergillusn niger) [ CMCC (F) 98003 ]

      菌液製備   接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35 ℃ 培養18～24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，20～25 ℃ 培養24～48 小時，上述培養物用0.9 ％氛化鈉溶液製成每lml 含菌數小於100CFU （菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基上，23～28 ℃ 培養5～7 天，加入3～5ml 無菌的含0.05 % (ml/ml）聚山梨酯80的0.9 ％氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用無菌的含0.05 ％〔ml/ml）聚山梨酯80 的0.9 ％氯化鈉溶液製成每lml 含孢子數小於10OCFU 的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應在2 小時內使用，若保存於2～8 ℃ 可在24 小時內使用。黑曲黴孢子懸液可保存在2～8 ℃ ，在驗證過的貯存期內使用。

       培養基接種取每管裝量為12ml 的硫乙醇酸鹽流體培養基9 支，分別接種小於100CFU 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 支，另1 支不接種，作為空白對照，置30～35 ℃ 培養3 天；取每管裝量為9 而的改良馬丁培養基5 支，分別接種小於100CFU 的白色念珠菌、黑曲黴各2 支，另1 支不接種，作為空白對照，置20～25 ℃ 培養5 天。逐日觀察結果。結果判定空白對照管應無菌生長，若加菌的培養基管均生長良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。

 

      稀釋液、衝洗液及其製備方法
      稀釋液、衝洗液配製後應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。

      (1)0.1 ％蛋白腖水溶液   稱取蛋白腖1.0g ，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調pH 值至7.1士0.2，分裝，滅菌。

      (2) pH7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液   稱取磷酸二氫鉀3.56g 、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白腖1.0g, 加水I000ml ，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。

      (3）0.9 ％氯化鈉溶液   稱取氯化鈉9.0g ，加水溶解使成1000ml ，過濾，分裝，滅菌（僅用於上述2 種溶液不適用時使用）。

       根據供試品的特性可選用其他經驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、衝洗液。如需要，可在上述稀釋液或衝洗液的滅菌前或滅菌後加人表麵活性劑或中和劑等。

 

      當建立產品的無菌檢查法時，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合於該產品的無菌檢查。若該產品的組分或原檢驗條件發生改變時，檢查方法應重新驗證。驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。菌種及菌液製備同培養基靈敏度檢查。薄膜過濾法取每種培養基規定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，衝洗，在最後一次的衝洗液中加入小於100CFU 的試驗菌，過濾。將培養基加至濾筒內。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照，細菌置30～35 ℃ 、真菌置20～25 ℃ 培養3～5 天，逐日觀察各濾筒內試驗菌的生長情況。

      直接接種法   取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8 管，分別接入小於100CFU 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 管，取符合直接接種法培養基用址要求的改良馬丁培養基4 管，分別接入小於10OCFU 的白色念珠菌、黑曲黴各2 管。其中l 管接入每支培養基規定量的供試品量，另1 管作為對照，細菌置30～35 ℃ 、真菌置20～25 ℃ 培養3～5 天，逐日觀察各濾筒內試驗菌的生長情況。

      結果判定   與對照管比較，如含供試品的各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗且在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗且在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加衝洗量、增加培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，並重新進行方法驗證試驗。

      驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。

 

      抽驗數量    係指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量（支或瓶）。成品每亞批均應進行無菌檢查。除另有規定外，原液、半成品及成品按表1 規定，上市產品監督檢驗按表2 規定。

      接種量    係指每個最小包裝的最少取樣量（ml或g ）。除另有規定外，接種供試品量按表3 規定。若采用直接接種法，按接種量要求等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基中（ 兩種培養基的接種支（瓶）數之比為2：1 ) ；若采用薄膜過濾法，應采用三聯薄膜過濾器，其中兩聯加入硫乙醇酸鹽流體培養基，另一聯加入改良馬丁培養基。隻要供試品特性允許，應將所有容器內的內容物全部過濾。

      陽性對照   以金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌。供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照試驗的菌液製備同培養基靈敏度檢查項下金黃色葡萄球菌菌液製備方法，加菌量小於100CFU。陽性對照也可在供試品無菌檢查培養14 天後，取其中1 份硫乙醇酸鹽流體培養基，加入小於100CFU 陽性對照菌，作為陽性對照。陽性對照置30～35 ℃ 培養48～72 小時應生長良好。

      陰性對照   供試品無菌檢查時，應取相應溶劑、稀釋液和衝洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

     無菌試驗過程中，若需使用表麵活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物生長無毒性。

     無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。隻要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。供試品的  無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。

      操作時，用適宜的消毒液對供試品容器表麵進行徹底梢毒。如果供試品容器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作啟開容器，取出內容物。

      除另有規定外，按下列方法進行。

      采用封閉式薄膜過濾器，濾膜孔徑應不大於0.45μm直徑約為50mm 。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。使用時，應保證濾膜在過濾前後的完整性。

      水溶性供試品溶液過濾前先將少量的衝洗液過濾，以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分幹燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及衝洗液粗蓋整個濾膜表麵。供試品溶液經薄膜過濾後，若需要用衝洗液衝洗濾膜，每張濾膜每次衝洗量一般為100ml ，總衝洗量不得超過l000ml ，以避免濾膜上的微生物受損傷。

       水溶液供試品   取規定量，每支（瓶）供試品裝量為5ml 及以下者，全部轉移至含適宜稀釋液100ml 的無菌容器內，混勻，立即過濾；每支（瓶）供試品裝量為5ml 以上者直接過濾，或全部轉移至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用衝洗液衝洗濾膜，衝洗次數一般不少於3 次，所用的衝洗量、衝洗方法同方法驗證試驗。衝洗後，2 個濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養基各100ml ，另一濾器中加入改良馬丁培養基100ml 。

      水溶性固體供試品    取規定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明複溶，然後照水溶液供試品項下的方法操作。

      非水溶性供試品  取規定量，混合溶於含聚山梨酯80 或其他適宜乳化劑的稀釋液300ml的無菌容器內，充分混合，立即過濾。用含0.1 % ～1 ％聚山梨酯80 的衝洗液衝洗濾膜，衝洗次數一般不少於3 次。加入含或不含聚山梨酯80 的培養基。其他照水溶液供試品項下的方法操作。

       可溶於十四烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品   取規定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯中，劇烈振搖，使供試品充分溶解。如果需要可適當加熱，但溫度不得超過44 ℃ ，並趁熱迅速過濾。對仍然無法過濾的供試品，於含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試品溶液中加入不少於100ml 的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試品溶液過濾。過濾後濾膜衝洗及加入培養基照非水溶性供試品項下的方法操作。

      無菌氣（噴｝霧劑供試品   取規定量，將各容器置至少-20 ℃ 的冰室冷凍約1 小時。以無菌操作迅速在容器上端鑽一小孔，釋放拋射劑後再無菌開啟容器，並將供試品溶液轉移至無菌容器中，然後照水溶液或非水溶性製劑供試品項下的方法操作。

      裝有藥物的注射器供試品   取規定量，將注射器中的內容物（若需要可吸人稀釋液或標簽所示的溶劑溶解）直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾，然後按水溶性供試品項下方法操作。

       同時應采用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。

       直接接種法適用於無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。取規定量供試品，等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基中（2 種培養基的接種支數或瓶數之比為2:1 ) 。除另有規定外，每個容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積，不得大於培養基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少於15ml ，改良馬丁培養基每管裝且不少於10ml 。培養基的用量和高度同方法驗證試驗。

       混懸液等非澄清水溶液供試品   取規定量，等量分別接種至各管培養基中。

       固體供試品   取規定量，加入適宜的稀釋劑溶解，或按標簽說明複溶後混合，等量分別接種至各管培養基中。

      非水溶性供試品   取規定量，混合，加入適量的聚山梨酯80 或其他適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化；等量分別接種至各管培養基中，或等量分別直接接種至含聚山梨酯80 或其他適宜乳化劑的各管培養基中。

      培養及觀察   將上述接種後的硫乙醇酸鹽流體培養基平均分成兩份，一份置30 ～35 ℃ 培養14 天；另一份與接種後的改良馬丁培養基置20 ～25 ℃ 培養14 天，培養期間應逐日觀察並記錄是否有菌生長。如在加入供試品後或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14 天後，不能從外觀上判斷有無細菌生長，可取該培養液轉種至同種新鮮培養基中及營養瓊脂斜麵和改良馬丁瓊脂斜麵培養基上，細菌培養2天，真菌培養3天，觀察接種的同種新鮮培養基及營養瓊脂和改良馬丁瓊脂斜麵培養基上是否有菌生長；或取培養液（物）塗片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時做菌種鑒定。

      結果判定   陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。

      若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無細菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任何一管顯渾濁並確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少1個條件時方可判試驗結果無效：

       （1）無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求。

       （2）回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物汙染的因素。

       （3）供試品管中生長的微生物經鑒定後，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。

       試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查若無菌生長，判供試品符合規定；若有菌生長，判供試品不符合規定。

      

        表1出廠製品不同規格及原液和半成品量最少抽檢數量

 

       表2  上市製品監督抽驗數量

 

      表3 不同規格製品的最少接種量