細菌內毒素檢查法

 

      本法係利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。

      細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，後者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠法結果為準。

      本試驗操作過程應防止微生物和內毒素的汙染。

      細菌內毒素的量用內毒素單位（EU ）表示，1EU 與1 個內毒素國際單位（IU ）相當。
      細菌內毒素國家標準品係自大腸埃希菌提取精製而成，用於標定、複核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品的效價。

      細菌內毒素工作標準品係以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用於試驗中的賞試劑靈敏度複核、幹擾試驗及各種陽性對照。

      細菌內毒素檢查用水係指內毒素含量小於0.O15EU／ml（用於凝膠法）或0.005EU / ml （用於光度側定法）且對內毒素試驗無幹擾作用的滅菌注射用水。

      試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。耐熱器皿常用幹熱滅菌法（250℃ 、30 分鍾以上 ) 去除，也可采用其他確證不幹擾細菌內毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素並且對試驗無幹擾的器械。

 

      供試品溶液的製備   某些供試品需進行複溶、稀釋或在水性溶液中浸提製成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH 值在6.0～8.0的範圍內。對於過酸、過堿或本身有緩衝能力的供試品，需調節被測溶液（或其稀釋液）的pH 值，可使用酸、堿溶液或適宜的緩衝液調節pH 值。酸或堿溶液須用細菌內毒素檢查用水在已去除內毒素的容器中配製。緩衝液必須經過驗證不含內毒素和幹擾因子。

     內毒素限值的確定   藥品、生物製品的細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定：

                                       L=K / M

   式中   L 為供試品的細菌內毒素限值，一般以EU /ml、EU / mg 或EU / U （活性單位）表示；

            K 為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU / ( kg · h ）表示，注射劑K = 5EU/(kg•h ) ，放射性藥品注射劑K=2.5EU / （kg· h ) ，鞘內用注射劑K = 0.2EU / （kg· h ) ；

            M 為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml / ( kg · h ）、mg / ( kg · h ）或U / ( kg · h ）表示，人均體重按60kg 計算，人體表麵積按1.62m² 計算。注射時間若不足1 小時，按1 小時計算。供試品每平方米體表麵積劑量乘以0.027 即可轉換為每千克體重劑量（M）。

按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨床用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。

        確定最大有效稀釋倍數（MVD ）  最大有效稀釋倍數是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數( 1→MVD )，在不超過此稀釋倍數的濃度下進行內毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD :

MVD=cL / λ

式中   L 為供試品的細菌內毒素限值；

         c 為供試品溶液的濃度，當L 以EU / ml 表示時，則c等於1.0ml / ml ，當L 以EU / mg 或EU / U 表示時，c的單位需為mg / ml 或U / ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD 取1 ，可計算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L ；

         λ為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度〔 EU / ml ) , 或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。

 

      凝膠法係通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。

      鱟試劑靈敏度複核試驗   在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU / ml 表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度複核試驗。

      根據賞試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦棍合器上混勻15分鍾，然後製成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30 秒鍾。取分裝有0.1ml 鱟試劑溶液的10mm×75mm 試管或複溶後的0.1ml/支規格的鱟試劑原安瓶18 支，其中16 管分別加入0.1ml 不同濃度的內毒素標準溶液，每一個內毒素濃度平行做4 管；另外2 管加人0.1ml 細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻後，封閉管口，垂直放人37 ℃ 士1 ℃ 的恒溫器中，保溫60 分鍾±2 分鍾。

       將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉l80° ，若管內形成凝膠，並且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形並從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應避免受到振動造成假陰性結果。

       當最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效．按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λ_c）。

λ_c＝antilg （∑X / 4 )

式中   X 為反應終點濃度的對數值（lg ）。反應終點濃度是指係列遞減的內毒素濃度中最後一個呈陽性結果的濃度。

       當λ_c在0.5λ～2λ(包括0.5λ～2λ)時，方可用於細菌內毒素檢查，並以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

      幹擾試驗   按表1 製備溶液A 、B 、C 和D ，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數( MVD ）的溶液，按鱟試劑靈敏度複核試驗項下操作。

注：A為供試品溶液；B為幹擾試劑係列；C鱟試劑標示靈敏度的對照係列；D為陰性對照。

隻有當溶液A 和陰性對照溶液D 的所有平行管都為陰性，並且係列溶液C 的結果在鱟試劑靈敏度複核範圍內時，試驗方為有效。按下式計算係列溶液C 和B 的反應終點濃度的幾何平均值（E_s和E_t ) :

E_s= antilg （∑X_s / 4 )

E_t=antilg （∑X_t : / 4 )

式中X_s X_t分別為係列溶液C 和溶液B 的反應終點濃度的對數值（lg）。

      當E_s在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及E_t在0.5E_s～ 2 E_s （包括0.5E_s和 2 E_s）時，認為供試品在該濃度下無幹擾作用。若供試品溶液在小於MVD 的稀釋倍數下對試驗有幹擾，應將供試品溶液進行不超過MVD 的進一步稀釋，再重複幹擾試驗。

       可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除幹擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除幹擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行幹擾試驗。

       當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行幹擾試驗。

       當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行幹擾試驗。

 

     ( l )凝膠限度試驗  按表2 製備溶液A 、B 、C 和D 。使用稀釋倍數為MVD 並且已經排除幹擾的供試品溶液來製備溶液A 和B 。按鱟試劑靈敏度複核試驗項下操作。

 

 

注：A 為供試品溶液；B 為供試品陽性對照；C 為陽性對照；D 為陰性對照。

 

     結果判斷   保溫60 分鍾±2 分鍾後觀察結果。若陰性對照溶液D 的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B 的平行管均為陽性，陽性對照溶液C 的平行管均為陽性，試驗有效。
     若溶液A 的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規定；若溶液A 的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規定。若溶液A 的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行複試。複試時，溶液A 需做4 支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規定；否則判定供試品不符合規定。
      （2）凝膠半定量試驗   本方法係通過確定反應終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。按表3 製備溶液A 、B 、C 和D 。按鱟試劑靈敏度複核試驗項下操作。

      結果判斷   若陰性對照溶液D 的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B 的平行管均為陽性，係列溶液C 的反應終點濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間，試驗有效。

     係列溶液A 中每一係列平行管的終點稀釋倍數乘以λ，為每個係列的反應終點濃度，所有平行管反應終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度[按公式c_E=antilg（∑X / 2 ）] 。如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘以稀釋倍數。
     如試驗中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應記為內毒素濃度小於λ（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記為小於λ乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數）。如果供試品溶液的所有平行管均為陽性，應記為內毒素的濃度大於或等於最大的稀釋倍數乘以λ。

      若內毒素濃度小於規定的限值，判定供試品符合規定。若內毒素濃度大於或等於規定的限值，判定供試品不符合規定。

 

注：A為不超過MVD並且通過幹擾試驗的供試品溶液。從通過幹擾試驗的稀釋倍數開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，最後的稀釋倍數不得超過MVD。

      B為2λ濃度標準內毒素的溶液A（供試品陽性對照）。

      C為鱟試劑標示靈敏度的對照係列。

       D為陰性對照。

 

      光度測定法分為濁度法和顯色基質法。

       濁度法係利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，可分為終點濁度法和動態濁度法。終點濁度法是依據反應混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度或透光率）之間存在著量化關係來測定內毒素含量的方法。動態濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。

     顯色基質法係利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，分為終點顯色法和動態顯色法。終點顯色法是依據反應混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關係來測定內毒素含量的方法。動態顯色法是檢測反應混合物的色度達到某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或檢測色度增長速度的方法。

      光度測定試驗需在特定的儀器中進行，溫度一般為37℃ ±1℃ 。

       供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。

       為保證濁度和顯色試驗的有效性，應預先進行標準曲線的可靠性試驗以及供試品的幹擾試驗。

       標準曲線的可靠性試驗   當使用新批號的鱟試劑或試驗條件有任何可能會影響檢驗結果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。

       用標準內毒素製成溶液，製成至少3 個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數不得大於10），最低濃度不得低於所用鱟試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3 支平行管。同時要求做2 支陰性對照。當陰性對照的反應時間大於標準曲線最低濃度的反應時間，將全部數據進行線性回歸分析。

       根據線性回歸分析，標準曲線的相關係數（r）的絕對值應大於或等於0.980 ，試驗方為有效。否則須重新試驗。

      幹擾試驗   選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度（設為λm），作為供試品幹擾試驗中添加的內毒素濃度。按表4 製備溶液A 、B 、C 和D 。

 

注：A 為稀釋倍數不超過MVD 的供試品溶液。

      B 為加人了標準曲線中點或靠近中點的一個已知濃度內毒素的，且與溶液A 有相同稀釋倍數的供試品溶液。

      C 為如“標準曲線的可靠性試驗”項下描述的，用於製備標準曲線的標準內毒素溶液。

      D 為陰性對照。

     按所得線性回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒紊含量c_t和c_s，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R ）。

R = (c_s-c_t ) ×100 %

     當內毒素的同收率在50 ％—200 ％之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在幹擾作用。

     當內毒素的回收率不在指定的範圍內，須按“凝膠法幹擾試驗”中的方法去除幹擾因素，並重複幹擾試驗來驗證處理的有效性。

      當鱟試劑、供試品的來源、處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行幹擾試驗。

      檢查法   按“光度測定法的幹擾試驗”中的操作步驟進行檢測。

      使用係列溶液C 生成的標準曲線來計算溶液A 的每一個平行管的內毒素濃度。

      試驗必須符合以下三個條件方為有效：

     ( 1 ）係列溶液C 的結果要符合“標準曲線的可靠性試驗”中的要求；

     ( 2 ）用溶液B 中的內毒素濃度減去溶液A 中的內毒素濃度後，計算出的內毒素的回收率要在50 % ～200 ％的範圍內；

     ( 3 ）溶液D 的反應時間應大於標準曲線最低濃度的反應時間。

     結果判斷  若供試品溶液所有平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數後，小於規定的內毒素限值，判定供試品符合規定．若大於或等於規定的內毒素限值，判定供試品不符合規定。
注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應容器，如微孔板中的孔。