結核杆菌的檢驗

       結核杆菌與麻風杆菌是分枝杆菌屬中的主要病原菌。

       結核杆菌菌體細長略帶彎曲，有分枝生長趨勢。菌體含脂量高，與其抗酸特性、抵抗力特性、致病性與免疫性等都有密切關係。該菌營養要求高，生長緩慢，形成“菜花狀”菌落。

 

       結核病人病灶中查到結核杆菌，是病原學診斷的重要依據，根據感染部位不同，可采集病人的痰、尿、糞便、腦脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序進行檢驗。

 

       1.  液體培養基（蘇通氏培養基、小川培養基、血清酸性培養基等）結核杆菌生長表現：標本材料經前處理（即酸堿處理，可液化標本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）後接種液體培養基，35℃培養1-2周，由於表麵生物，可在培養基表麵表成汙灰、幹燥、有皺褶的菌膜。
　　2.  固體培養基（改良羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基等）結核杆菌生長表現：標本材料經前處理後，接種固體培養基，37℃培養2-4周，在培養基表麵可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節狀堆聚的菌落，呈現“菜花狀”。
　　3.  結核杆菌快速培養檢測方法：無菌手續將前處理後的材料塗片，置液體培養基中，35℃恒溫箱CO2培養箱內培養，3-5日後，每隔日取出一玻片，染色鏡檢，可快速獲得結果。

 

三、齊~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法

【原理】

      結核杆菌對苯胺染料不易著色，若加溫或延長染色時間使其著色後，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，再經美蘭複染，結核杆菌及其他分枝杆菌仍呈紅色，而非抗酸菌和細胞雜質等呈藍色。

【材料】

        1.   結核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或濃縮集落菌法處理過的痰標本。
　　  2.  抗酸染色液
　  　3.   載物玻片、玻片夾、酒精燈、臘筆等。

【方法】

       1.  無菌手續采取痰液塗片，自然幹燥，火焰固定。
　　 2.  用臘筆將塗麵局部隔開，滴加石炭酸複紅染液，酒精燈上加熱至出現蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液幹涸。如有幹涸的趨勢，應及時補加染液。持續染色5-8分鍾，待冷後流水漂去多餘的染液。
　　3.  用3%鹽酸酒精清脫色，脫至塗麵無色為止，約1-3分鍾，自來水衝洗。
　　4.  滴加呂氏美蘭染液複雜30秒~1分鍾，水洗。自然幹燥或吸幹後油鏡檢查。

【結果】

      1.   結核杆菌呈現細長，略有彎曲的紅色菌體，有的可表現出分枝特征，有的菌體表現有多數濃染顆粒。結核杆菌大多分散排列，亦可以見到有縱行條索狀排列。
　　2.  塗片染色能查到結核杆菌者，一般需要每毫升痰液內含菌量至少應有500個以上，甚至需達到5萬以上。故材料多進行濃縮集菌處理，以提高檢出陽性率，也造成在染色標本片觀察中，不一定每個視野都能看到結核杆菌。
　　3.  結核杆菌易發生變異，在陳舊培養基或臨床治療後標本材料中，結核杆菌往往菌體斷裂，或形成非抗酸性革蘭氏陽性的短杆狀、球狀顆粒，亦稱Much顆粒。
　　4.  標本已經高壓滅菌處理，不影響染色結果，也保證操作者的安全。

 

      此係用金胺熒光素染擴酸性細菌的方法，簡便易行，但不具特異性。金胺染色法有多種、現列於後表，可選擇使用，應用熒光顯微鏡檢查結果。

 

 

【材料】

       1.   動物：體重200~250克豚鼠2隻
　　 2.   結核杆菌培養物或結核病人檢驗材料（痰、尿、糞、腹水等材料經濃縮集菌）
　　 3.   注射器及消毒用材料等。

【方法】

       1.   選取結核菌素試驗為陰性的豚鼠兩隻。
　　 2.   吸取結核杆菌懸液或病人檢材，注入豚鼠腹股溝皮下0.1ml
　　 3.   注射後每周定期檢查一次，觀察豚鼠腹股溝淋巴結是否腫大，局部變硬，化膿及體重減輕、體溫升高等症狀。
　　 4.   給豚鼠作結核菌素試驗，是否出現陽性結果。
　　 5.   6周後，將豚鼠進行解剖，觀察淋巴結是否腫大，有無幹酪性病變，肝、脾、肺等是否腫大，表麵有無灰白色結節病灶，取可疑病灶進行塗片染色鏡檢和分離培養。若為陽性結果，可報告“動物接種後××天查到有結核菌感染”。如無症狀及病變者，可報告為陰性。

 

【材料】

         結核病人24小時痰液，細口瓶，0.02%酚紅液、汽油，NaOH，無菌生理鹽水等。

【方法】

(一)漂浮法：

      1.   取24小時痰液15毫升，裝入細口瓶內，加入2倍量0.5%NaOH搖勻，高壓滅菌或煮沸20—30分鍾殺菌。
　　2.   待冷後加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振蕩20—30分鍾，用生理鹽水加至液麵與瓶口齊，靜置半小時。
　　3.   取瓶口表麵油狀物塗於載物玻片上，微微加熱，幹後再加，如此重複5—6次，至厚度適宜，烘幹待冷，抗酸染色，油鏡頭檢查。

 

(二)沉澱法：

      1.   取痰液1份或2倍量4%NaOH，高壓無菌或煮沸20—30分鍾後，加入0.02%酚紅指示劑0.1毫升，劇烈振蕩混勻，亦可置37℃水浴消化30分鍾。
　　2.   矯正PH為7.0，3000轉/分離心30分鍾，棄去上清液。
　　3.   取沉澱物塗片染色鏡檢。若進行分離培養和動物接種，可免去高壓滅菌或煮沸的程序。

 

附錄：抗酸染液的配製

      1.   石炭酸複紅液：稱取鹼性複紅4克，溶於95%酒精100毫升中成飽和液。再取飽和液10毫升與5%石炭酸溶液90毫升混勻即成。
　　2.   3%鹽酸酒精：取濃鹽酸3毫升，95%酒 97毫升混合。
　　3.   呂弗勒氏鹼性美蘭液：稱取美蘭2克，溶於95%酒精100毫升中，配成飽和液，取飽和液30毫升，再加入蒸餾水100毫升及10%氫氧化鉀水溶液0.1毫升即成。