菌種保藏技術

    此法是斜麵保藏的一種改進方法，常用於保藏各種需氣性細菌。方法是將培養基製成軟瓊脂（瓊脂含量為斜麵的1/2，一般為1%），盛入1.2×10cm的小試管或螺旋口小試管內，高度為試管的1/3。121℃高壓滅菌後不製成斜麵，用針形接種針將菌種穿刺接入培養基的1/2處。培養後的微生物在穿刺處及瓊脂表麵均可生長。然後覆蓋以2~3mm的無菌液體石蠟。液體石蠟必須高壓滅菌2次。這樣的小管可在冰箱中保存以減少微生物的代謝作用。因此保藏效果較斜麵為好。如果不用穿刺法而直接將液體石蠟加入生長好的斜麵上亦可得到相似的效果，而且適用的範圍較廣，真菌放線菌都可適用。但發現液體石蠟減少應及時補充。穿刺法及液體石蠟覆蓋法都很簡便，但保藏期卻因微生物種類不同而有很大的差異，真菌有的可保藏達10年之久，對一些形成孢子能力很差的絲狀真菌，液體石蠟覆蓋法行之有效。而另一些菌種如固氮菌、分支杆菌、沙門氏菌、毛黴等卻不適宜。此外，從液體石蠟覆蓋層下移種時，接種針在火焰上燒灼時菌體會隨著液蠟四濺，如果培養物是病原菌時，應予注意。第一代的培養物會有液蠟的殘跡和複壯問題，第二代才適於實驗用。

2.斜麵保藏法

    這是一種最基本的方法，適用範圍廣，細菌、真菌及放線菌都可應用。當微生物在適宜的斜麵培養基和溫度條件下生長良好後，一般在4℃左右可保藏3~6個月。到期後重新移種一次。當然保藏溫度和時間都不是絕對的，個別菌種甚至在37℃保藏為宜，也有的需要1~2周傳代一次。這種方法的弊端是傳代次數多了容易發生變異，如產生孢子能力下降、發酵能力減弱、毒力減小甚至基因失落等，傳代次數多也容易使汙染機會增加。目前許多實驗室采用密封性能較好的螺旋口試管替代傳統的棉塞和減少碳水化合物的含量的方法，更有利於菌種的保藏。

     這種方法適用於形成芽孢子的細菌、形成孢子的絲狀真菌和放線菌。其原理是將微生物吸附在各種載體上，幹燥後保藏。一般將園土或耕作土研細、過篩（24篩目），幹燥後使用，也可以用沙子過篩後以氫氧化鈉和鹽酸交替洗淨後作為載體。在1.2×10cm小試管內盛入土壤或砂子至1cm高度，121℃高壓滅菌2~3次。細菌可加入濃的懸液，真菌和放線菌可直接刮下孢子混和，大體上目測載體稍有濕潤即可。小試管放入真空幹燥器中或在幹燥器中加五氧化二磷作為吸水劑幹燥，試管口可熔封亦可用石蠟封口後，仍放在幹燥器械內在5℃保藏。其保藏期一般為2年，有些微生物可長達10年之久。室溫保藏效果較差。使用時，隻需將少量土壤或砂子均勻傾倒在斜麵上，生長好後再移種一次供使用。除了用土壤或砂子作為載體外，亦可使用6~12篩目過篩的矽膠、磁珠或多孔玻璃珠、以及曲子和麥粒來代替，矽膠必須是無色的，著色的矽膠指示劑對微生物有毒性，在矽膠中加入菌液時由於生產吸附熱，溫度會相應增高，接種時要將盛有矽膠的小試管置於水中冷卻。砂子及土壤是更為常用的載體。

 

 

      液氮罐在目前來說已是實驗室較容易購置。用液氮罐來保藏菌種，效果好、方法簡單、保藏的對象也最為廣泛。其方法是將濃的懸液加入滅菌後的分散劑中，細菌加入最終濃度為10%的甘油或5%二甲基亞碸（DMSO（作為防凍的保護劑滅菌後加入）pH7.6。這種營養明膠可製成良好的細菌懸液，許多細菌可保藏4年之久。此法操作簡便但無菌要求較高。

 
    懸液法的基本原理是將微生物懸浮於不含養分的溶液如蒸餾水、0.25M磷酸緩衝液（Ph6.5）或生理鹽水中保藏。適用於絲狀真菌、酵母型真菌及細菌中的腸道菌科。大部分能保藏1年或更長。此法的關鍵是要用密封性能好的螺旋口試管或一般試管加橡皮塞以防止水分的蒸發。保藏在4℃、10℃或室溫（18~20℃）。目前國內生產廠應用玉米發酵醪在冰箱中保種，接種時即將老的發酵醪接入新鮮玉米醪，經熱處理後進行保溫培養。

 

     此法是在較高的真空度下，將液態樣品直接減壓幹燥，常被稱為L-幹燥保藏法（drying from the liquid state的簡稱）。對於病毒、噬菌體、有些螺旋體效果勝於冷凍幹燥法。細菌和酵母亦能使用。在安瓿管中加入1～2滴微生物懸液，切除管口棉塞並將棉塞部推入安瓿管內以便在棉塞上端將管子拉細。棉塞的鬆緊是操作的要點。這樣的安瓿管直接裝在孔管上用真空泵減壓幹燥，其真空度約至0.1托時表在同基本幹燥後，再抽1h即可熔封。樣品的溫度有的是維持在20℃水浴中，有的裝置可使溫度降至10℃，但總不會達到冰點。幹燥的時間需要10～20h或過夜。這種方法可能因使用不多，保藏期限報道較少。噬菌體的保藏期為5年左右。

 

 

     此法的基本原理是將小試管中的菌液，不經過冷凍而直接抽幹保藏。一般用0.8×6cm有棉塞的小試管，加入以脫脂牛乳等分散劑製成的細菌懸液。懸液中細菌的濃度應高而加入小試管的數量應少，一般不超過5滴，將小試管振蕩使懸液附於管壁，貼上標簽後，放入12×150cm的大試管中，大試管底部加入少量五氧化二磷及幾粒小玻璃珠使小試管不直接與幹燥劑接觸。大試管的口上配有中間插有玻璃管的橡皮塞。將真空泵與橡皮管聯接，抽真空至0.05托左右。可以用石蠟將橡皮塞和玻璃管全部封住，也可以在橡皮塞下部將大部試管拉細，第二次抽真空熔封。在5℃低溫下保藏時，NCTC曾報道保藏了2724個菌種，14年後的存活率為83%。酵母及絲狀真菌可保藏數年，但對一些敏感的菌珠不適用。

      用這種方法保藏菌種已有幾十年的曆史，由於它具有保藏期長、變異小、便於大量保藏及適用範圍較廣等優點，是各保藏機構使用的主要方法。曾有報導ATCC保藏的6,500個菌種中隻有不到100個無法用這種方法保藏，病原菌中的98.5%適用。僅有一些不產孢子的絲狀真菌不宜用此法。其基本原理是將微生物或孢子冷凍，然後在減壓情況下利用升華現象除去水分，使細胞的代謝、生理等生命活動處在停止狀態下進行長期保藏。此法可用小箱式或多孔道的冷凍幹燥機進行，亦可自製一簡單的裝置進行。它的操作步驟稍複雜一些，下麵將分別敘述。

（1）收集菌種： 作為長期保藏的菌種，應當選擇最適培養基和溫度以便得到良好的培養物。培養時間要掌握在生長後期，因為對數生長期的細菌對冷凍幹燥的抵抗力較弱，有孢子的微生物需適當的培養以期得到成熟的孢子。大致說，細菌是24~48h，酵母為72h，放線菌和絲狀真菌是7~8天以上。從理論上說，最好是用生理鹽水或緩衝液將斜麵上刮下的菌體或孢子洗幾次，以期洗淨培養基中可能帶來的各種物質。但在實際操作中如果洗淨的條件不適宜會使細胞受損，同時也增加了汙染的可能性，一般都省略了這一步驟。操作時先將少量分散劑（保護劑）加入斜麵中，輕輕刮下菌苔或孢子，注意不要劃破斜麵而帶入培養基，也可通過紗布脫脂棉的過濾，製成均勻的懸液。懸液的細胞濃度，因細菌和孢子大小不一，不易訂出統一的標準，細菌可保持在109~1010/ml左右，孢子應盡可能分散從而製成20支安瓿管。如果用液體培養，則在離心後除去上清液，每10ml所得的菌體可加入1~2ml的分散劑。這個步驟中必需嚴格的遵守無菌操作和檢驗培養的程度，因保藏期較長，培養物不純或操作汙染都會造成不良的後果。製成懸液後即在同樣嚴格的無菌條件下用毛細滴管加入滅菌好的安瓿管中，每個安瓿管裝量約為0.1~0.2ml，但不必準確控製，通常加入3~4滴即可。

（2）安瓿管的準備: 冷凍幹燥用的安瓿管形狀不一，有的是直形小管，有的在底部帶球形，有一些病原菌更需要在安瓿管內再裝入很小的玻璃套以保證安全。安瓿管的內徑為8~10mm，長度不小於100mm。安瓿管的玻璃要求中性、能耐熱、耐壓、耐溫度的驟變和管底厚度均勻，先用毛細滴管加入洗液浸泡過夜，第二天用水及蒸餾水洗淨後幹燥，瓶口加脫脂棉塞用紙包好，在121℃滅菌30min後，再在60℃烘箱中幹燥。幹燥溫度不宜過高以防止脫脂棉被烤焦。

（3）分散劑 ：分散劑或稱保護劑，其作用有二：一是使懸浮液懸浮其中保持活的狀態；二是減少冷凍幹燥時對微生物引起的損傷。分散劑大致可分為低分子化合物如氨基酸、有機酸、糖類等；高分子化合物如蛋白質、多糖等，原則上是二者配合使用的。ATCC及NRRL用馬血清、NCTC用1:3的營養肉湯和馬血清加入7.5%的葡萄糖。常用的是脫指牛乳和血清。最簡單的是將普通牛乳離心後除去上層乳脂，常壓滅菌3次每次1h，溫度過高將影響保藏的效果。血清要過濾滅菌，牛乳可加熱滅菌且冷凍幹燥後易形成均勻粉末故更為常用。

（4）冷凍：裝入懸液的安瓿管應立即冷凍，不宜放置過久。時間長了會使用菌體自行沉澱成為不均勻的懸液而不利冷凍，同時還會使分散劑起培養基的作用使微生物再次生長或萌發了孢子，這些情況都不利於長期保藏。冷凍的溫度達到-30℃以下即可，有冷凍幹燥機的可在冷凍架上進行，否則用一個盛有幹冰的廣口熱水瓶將安瓿管在幹冰中轉動幾下即可。冷凍後的安瓿管應立即真空幹燥。

（5）真空幹燥：真空幹燥可用小箱式的冷凍幹燥機，冷凍結束後立即啟動真空泵，在15min內使小箱內真空度達到0.5托，1托的真空度約為1mmHg（1mmHg=133.322Pa）以上。隨著真空度上升至0.1 托以上，可以升高箱板的溫度，使小箱內的溫度升至25~30℃。此時由於升華還在繼續，樣品不會融化而能達到幹燥的目的。如果有後幹燥裝置，可以利用油泵進行後幹燥，真空箱內的真空度可達到0.01托以上，幹燥效果更好。幹燥完畢後關閉真空泵、排氣、取出安瓿管將管頸拉細，再裝在多孔管道上抽真空和融封。這種裝置每次可冷凍幹燥大量安瓿管，幹燥度和真空度都較高，每次需要的時間較長約在10h以上。

（6）離心式冷凍幹燥機：另有一種帶離心機的冷凍幹燥機，其主要區別是在真空箱內裝有一個可插入安瓿管口棉塞，插入預冷至-30℃~-50℃的小箱內離心機上。啟動離心機及真空泵，約15min後真空度達0.1托時，樣品已被冷凍。此時關閉離心機將樣品抽幹，如有加溫裝置，則在關閉離心機後逐步加溫至25~30℃使樣品加速幹燥，這種裝置可在數小時內完成全部過程。它的主要優點是在離心作用情況下抽真空，不會產生泡沫而影響冷凍幹燥的效果，但是安瓿管數受離心插頭號的限製和汙染的機會較多，並不常被采用。冷凍幹燥的裝置還有鍾罩式等，其基本原理與操作均相同，不一一列舉。

（7）安瓿管的熔封：熔封必須在第二次抽真空情況下，在多孔管道上進行。一般使用二或三個噴嘴的煤氣燈並由空氣壓縮機送入少量氧氣。熔封技術需很熟練，因為既要達到熔封完全無任何泄漏，同時又要求外觀完整均勻。熔封是在棉塞下部安瓿管已拉細處。

（8）標簽：安瓿管的標簽應當予以必要的注意，在大量保藏菌種時不允許有任何的差錯。可以在滅菌前加入有菌名、日期的小紙片，最簡單的是在加懸液前加入有菌名、日期的小條膠布。應當避免用水溶性的筆來寫標簽。

（9）安瓿管的保藏及影響保藏因素：安瓿管可放在冰箱內在4~5℃低溫下保藏。保藏期為5~10年。室溫保藏的效果不佳。影響保藏期的因素很多，菌種、菌齡、冷凍幹燥過程中各個環節都與之有關。保藏期和菌種變異關，在冷凍幹燥中主要是由於幹燥樣品中含水量的影響。通常含水量在1~3%時較好，5~6%就會相應降低，雖然不一定進行含水量的測定，可用目測或真空度來控製，但應當引起必要的注意，此法保藏的菌種可以長期保藏菌種的穩定，有報道（2）將保藏10年的12個屬的細菌進行生理、生化、血清學的測定而沒有發生變異，許多生產用的放線菌生理、生化、血清學的測定而沒有發生變異，許多生產用的放線菌等微生物菌種亦都采用這種保藏方法達到長期保存的目的。

（10）安瓿管的啟封：啟封時，在無菌條件下，將溶封口處在火焰上稍加熱，立即加上1~2滴無菌蒸餾水或用酒精棉花輕擦一下，使玻璃管產生裂縫，稍予輕擊即可斷落。加入最適生長的液體培養基少量使管內幹燥粉末溶解，即可接種在斜麵或液體培養基內，一般亦使用經過複壯的第二代菌種。