微生物基因表達的調控

目前常用的三種體外 DNA 連接方法為：

① 用 T4或 E.coli DNA連接酶可連接具有互補粘性末端的 DNA片段；

② 用 T4 DNA連接酶連接具有平末端的 DNA 片段；

③ 先在 DNA 片段末端加上人工接頭，使其形成粘性末端，然後再行連接。

④ 將粘性末端補平或修平（用單鏈酶，如綠豆芽核酸酶）連接

 

柯斯質粒用於克隆大片段的 DNA分子特別有效，而這種特性對於研究高等生物的基因組十分重要。其特點： 

1）具有 λ噬菌體的特性：在克隆了外源片段後可在體外被包裝成噬菌體顆粒，高效地感染對 λ噬菌體敏感的大腸杆菌細胞。進入寄主的柯斯質粒 DNA分子，按照 λ 噬菌體 DNA的方式環化， 但無法按噬菌體的方式生活，更無法形成子代噬菌體顆粒。 

2）具有質粒載體的特性：在寄主細胞內如質粒一樣進行複製，攜帶有抗性基因和克隆位點，並具氯黴素擴增效應。 

3）具有高容量的克隆能力：柯斯質粒本身一般隻有 5～7kb左右，而它克隆外源 DNA 片段的極限值竟高達 45kb，遠遠超過質粒載體及 λ 噬菌體載體的克隆能力。同時，由於包裝限製，  柯斯質 粒載體的克隆能力還存在一個最低極限值。  例如，5 kb大小的 柯斯質粒載體，插入的外源片段至少不能小於 30 kb。 

 

M13是大腸杆菌絲狀噬菌體，其基因組為環狀 ssDNA，  大小為 6407bp。其生活史為： 

1）通過性毛感染雄性（F+或 Hfr）大腸杆菌，或通過轉染進入雌性大腸杆菌細胞； 

2）進入細胞後，轉變成複製型  (RF)  dsDNA，然後以滾環方式製出 ssDNA。每當複製出單位長度正鏈，即被切出和環化，並被立即組裝成子代噬菌體和以出芽方式（即宿主細胞不被裂解）被釋放至胞外。 

M13克隆載體是對野生型 M13進行改造後建成，其特點是雖然克隆外源 DNA的能力較小，一般隻適於克隆 300～400bp 的外源 DNA 片段，但特別適合用於製備克隆基因的單鏈 DNA。主要被用於製備測序用單鏈 DNA模板、特異的單鏈 DNA探針，進行定位誘變等，也可用於噬菌體展示。