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發根農杆菌對植物的Ri質粒轉化與表達(一)



錄入時間:2010-8-6 15:28:31 來源:易生物

     轉基因植物在近代工業、醫藥業、特別是農業等各個領域的研究和應用越來越為人類所重視。通過農杆菌對植物植株、器官、組織及細胞的侵染進行質粒轉化,是將外源基因導入目的植物的重要方法之一。本實驗使同學了解農杆菌對植物質粒轉化的基本原理及具體操作過程,從而對轉基因植物的產生和外源基因轉入植物後產生的特殊性狀具有更加感性的認識。

      將外源基因人為導入天然植物中,從遺傳物質水平上對植物進行有目的改造,由此獲得轉基因植物,其性狀將按著有利於人們需要的方向發生改變。如轉基因的抗蟲棉花,通過人們的改造,使棉花在生長過程中體內能夠自主地產生抵抗害蟲的毒素,以達到自我保護、減少農藥使用增產增收的目的。

   隨著科學家的不斷探索,將人們獲得的有用基因轉入目的植物方法發展較快,現有農杆菌介導法、基因槍轟擊法、細胞顯微注射法、花粉管真空滲透法、化學法及電穿孔法等,其中農杆菌介導法是今仍然廣泛使用的一種有效轉化方法。農杆菌介導法所使用的質粒載體分根癌農杆菌和發根農杆菌兩大類。

通過發根農杆菌的侵染向目的植物轉入Ri質粒中的T-DNA,可使培養植物發生變態性的生長,專一性生長毛狀的發狀根。通過植物基因改造獲得的發狀根生長迅速且培養時不需要添加外源激素,同時發狀根擁有親本植株的特征次級代謝途徑和遺傳穩定性,幾乎無培養的退化問題,這些特點對植物生物工程的研究與應用具有重要的現實意義,例如通過發狀根培養來生產隻有在高度的根趨向分化細胞中才能產生的有用次生代謝物質等。

 發根農杆菌是一種寄主非常廣泛的土壤細菌,能夠浸染幾乎所有的雙子葉和少數的單子葉植物。其有不同的菌株,各自對一些相應的植物品種具有較強的侵染性,如A4 9402 Ar.15834等。發根農杆菌感染植物傷口,經一段時間後被感染的植物會在不定的部位生出發狀根。發狀根沒有向地性,可在無激素的培養基上培養生長,生長迅速並產生許多分枝,其增長速度一個月可增殖數倍到數百倍。發根農杆菌對植物的這種作用主要依賴於其菌體中的Ri質粒。

Ri質粒具有普通的質粒的特點:是細菌染色體外的遺傳物質,能獨立複製,為閉合環狀雙鏈DNA。它是非必要的遺傳物質,一般控製細菌的次要性狀,可自我複製並具有遺傳的穩定性,在特殊環境中對細菌的生存起著重要的作用。它具有可轉移性、可重組性、可整合性、可消除性等特點。Ri質粒的環狀基因可按功能可分為Vir、T-DNA、Ori三個區,該三個功能區在對植物的浸染與表達中分工明確。

Vir區的作用:該區基因不發生轉移,但它在T-DNA轉移的過程中起著十分重要的作用,這個區的缺矢或突變會使發根農杆菌的菌株喪失對植物的侵染能力。Vir區7個基因群(A-G)的A一直處於活性表達狀態而其它的6個基因通常情況下處於抑製狀態。發根農杆菌感染寄主時,被損傷的植物細胞會合成特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等,此時其可以與Vir區A基因的表達產物結合,誘導其它的聯合基因的活化,從而發生感染過程。

T-DNA區的特點與功能:T-DNA區的基因群具有致使發狀根產生(包括生長素合成)的有關基因、冠癭堿合成的有關基因以及某些抗性標記基因和特殊的酶切位點。其在侵染的過程中轉移到寄主的細胞中與其DNA相整合,從而隨寄主細胞中的DNA進行複製和表達。由於真核細胞中才具有T-DNA區的基因群中某些基因(如生長素合成的有關基因、冠癭堿合成的有關基因等)的功能啟動子,因而這些基因隻能在寄主真核細胞中轉錄表達,在農杆菌中處於抑製狀態。

Ori區的功能:在農杆菌中啟動質粒DNA的複製。

發根農杆菌將T-DNA轉入寄主的過程:首先受傷的植物從傷口處產生特殊的小分子酚類化合物乙酰丁香酮等,與Vir區A基因的表達產物結合,誘導其它的聯合基因的活化,從而發生感染過程,T-DNA區的兩端先後單鏈短裂,短裂下來的單鏈T-DNA被轉移到植物細胞中與植物的基因組隨機的整合,Ri質粒中移走的T-DNA區通過DNA複製得到修複,因此盡管發生了單鏈T-DNA的轉移,發根農杆菌細胞沒有因此喪失任何遺傳信息。

 

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