二、基因突變
一個基因內部遺傳結構或DNA序列的任何改變，包括一對或少數幾對堿基的缺失、插入或置換，而導致的遺傳變化稱為基因突變，其發生變化的範圍很小，所以又稱點突變或狹義的突變。染色體畸變是指大段染色體的缺失、重複、倒位、易位。廣義的突變包括染色體畸變和點突變。從自然界分離得到的菌株一般稱野生型菌株，簡稱野生型。野生型經突變後形成的帶有新性狀的菌株，稱突變株。
(一)基因突變的類型
基因突變的類型極為多樣。人們可從不同的角度對基因突變進行分類，並給以不同的名稱。根據突變體表型不同，可把突變分成以下幾種類型：
1.營養缺陷型：某一野生型菌株因發生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，因而無法在基本培養基（MM）上正常生長繁殖的變異類型，稱為營養缺陷型，它們可在加有相應營養物質的基本培養基平板上選出。營養缺陷型突變株在遺傳學、分子生物學、遺傳工程和育種等工作中十分有用。
2.抗性突變型：抗性突變型是指野生型菌株因發生基因突變，而產生的對某化學藥物或致死物理因子的抗性變異類型，它們可在加有相應藥物或用相應物理因子處理的培養基平板上選出。抗性突變型普遍存在，例如對一些抗生素具抗藥性的菌株等。抗性突變型菌株在遺傳學、分子生物學、遺傳育種和遺傳工程等研究中極其重要。
3.條件致死突變型：某菌株或病毒經基因突變後，在某種條件下可正常地生長、繁殖並呈現其固有的表型，而在另一種條件下卻無法生長、繁殖，這種突變類型稱為條件致死突變型。廣泛應用的一類是溫度敏感突變型。這些突變型在一定溫度條件下並不致死，所以可以在這一溫度中保存下來。它們在另一溫度下是致死的，通過它們的致死作用，可以用來研究基因的作用等問題。
4.形態突變型：形態突變型是指由突變引起的個體或菌落形態的變異，一般屬非選擇性突變。例如，細菌的鞭毛或莢膜的有無，黴菌或放線菌的孢子有無或顏色變化，菌落表麵的光滑、粗糙以及噬菌斑的大小、清晰度等突變。
5.抗原突變型：抗原突變型是指由於基因突變引起的細胞抗原結構發生的變異類型，包括細胞壁缺陷變異（L型細菌等）、莢膜或鞭毛成分變異等，一般也屬非選擇性突變。
6.其他突變型：如毒力、糖發酵能力、代謝產物的種類和產量以及對某種藥物的依賴性等的突變型。
(二)突變率
某一細胞（或病毒顆粒）在每一世代中發生某一性狀突變的概率，稱突變率。例如，突變率為10-8者，即表示該細胞在1億次分裂過程中，平均會發生1次突變。為方便起見，突變率也可以用某一單位群體在每一世代（即分裂一次）中產生突變株的數目來表示。例如，一個含108個細胞的群體，當其分裂為2×108個細胞時，即平均發生1次突變的突變率也是10-8。某一基因的突變一般是獨立發生的，它的突變率不會影響其他基因的突變率。這表明要在同一細胞中同時發生兩個或兩個以上基因突變的概率是極低的，因為雙重或多重基因突變的概率是各個基因突變概率的乘積，例如某一基因的突變率為10-8，另一為10-6，則雙重突變的概率僅10-14。
(三)基因突變的特點
基因突變一般有以下7個共同特點：
1.不對應性：即突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應關係。例如，細菌在有青黴素的環境下，出現了抗青黴素的突變體；在紫外線的作用下，出現了抗紫外線的突變體；在較高的培養溫度下，出現了耐高溫的突變體等。從表麵上看，會認為正是由於青黴素、紫外線或高溫的“誘變”，才產生了相對應的突變性狀。事實恰恰相反，這類性狀都可通過自發的或其他任何誘變因子誘發得到。這裏的青黴素、紫外線或高溫僅是起著淘汰原有非突變型(敏感型)個體的作用。
2.自發性：由於自然界環境因素的影響和微生物內在的生理生化特點，在沒有人為誘發因素的情況下，各種遺傳性狀的改變可以自發地產生。
3.稀有性：指自發突變的頻率較低，而且穩定，一般在10-6～10-9 間。
4.獨立性：突變的發生一般是獨立的，即在某一群體中，既可發生抗青黴素的突變型，也可發生抗鏈黴素或任何其他藥物的抗藥性。某一基因的突變，即不提高也不降低其他任何基因的突變率。突變不僅對某一細胞是隨機的，且對某一基因也是隨機的。
5.可誘變性：通過各種物理、化學誘變劑的作用，可提高突變率，一般可提高10～105倍。
6.穩定性：由於突變的根源是遺傳物質結構上發生了穩定的變化，所以產生的新性狀也是穩定的和可遺傳的。
7.可逆性：由原始的野生型基因變異為突變型基因的過程稱為正向突變，相反的過程則稱為回複突變。實驗證明，何性狀既有可能正向突變，也有可能發生回複突變，兩者發生的頻率基本相同。
（四）、基因突變的自發性和不對應性的證明
在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去很長一段時間中對這種抗性產生的原因爭論十分激烈。一種觀點認為，突變是通過適應而發生的，即各種抗性是由其環境(指其中所含的抵抗對象)誘發出來的，突變的原因和突變的性狀間是相對應的，並認為這就是“定向變異”。另一種看法則認為，基因突變是自發的，且與環境是不相對應的。從1943年起，經過幾個嚴密而巧妙的實驗設計，終於解決了這場紛爭。
1．變量試驗 又稱波動試驗或彷徨試驗。1943年Luria和Delbruck根據統計學的原理，設計了如下實驗。實驗要點是：取敏感於噬菌體T1的大腸杆菌對數期肉湯培養物，用新鮮培養液稀釋成濃度為103／m1的細菌懸液，然後在甲、乙兩試管內各裝10m1。接著把甲管中的菌液先分裝在50支小試管中(每管裝0.2m1)，保溫24—36小時後，即把各支小管的菌液分別倒在50個預先塗有T1的平板上，經培養後分別計算各皿上所產生的抗噬菌體的菌落數；乙管中的10ml菌液不經分裝先整管保溫24—36小時，然後才分成50份加到同樣塗有Tl的平板上，經適當培養後，同樣分別計算各皿上產生的抗性菌落數。結果發現，來自甲管的50皿中，各皿間抗性菌落數相差極大，而來自乙管的則各皿數目基本相同。這就說明大腸杆菌抗噬菌體性狀的突變，不是由所抗的環境因素——噬菌體誘導出來的，而是在它接觸到噬菌體前，在某一次細胞分裂過程中隨機地自發產生的。這一自發突變發生得越早，則抗性菌落出現得越多，反之則越少。噬菌體這裏僅起著淘汰原始的未突變的敏感菌和甄別抗噬菌體突變型的作用。利用這一方法，還可計算出突變率。
2．塗布試驗 1949年，Newcombe設計了一種與變量試驗相似，方法更為簡便的證實同一觀點的實驗，這就是塗布試驗。與變量試驗不同，他用的是固體平板培養法。先在12隻培養皿平板上各塗以數目相等(5×104)的敏感於噬菌體Tl的大腸杆菌細胞，經過5小時的培養，它們約繁殖了12.3代，於是在平板上長出大量的微菌落(這時每個菌落約含5100個細菌)。取其中的6皿直接噴上Tl噬菌體，另6皿則先用滅菌玻棒把平板的微菌落重新均勻塗布一遍，然後同樣噴上相應的T1。經培養過夜後，計算這兩組培養皿板上所形成的抗噬菌體菌落數。結果發現，在塗布過的一組中。共長出抗性菌落353個，要比未經塗布過的(僅28個菌落)高得多。這也意味著該抗性突變發生在未接觸噬菌體之前。噬菌體的加入隻起甄別這類自發突變是否發生的作用，而根本不是誘導突變的因素。
3．平板影印培養試驗 1952年Lederberg夫婦證明了微生物的抗藥性是在未接觸藥物前自發地產生的，這一突變與相應的藥物環境毫不相幹。所謂平板影印培養法，實質是一種能達到在一係列培養皿的相同位置上出現相同遺傳型菌落的接種培養方法。其基本過程是：把長有許多菌落(可多達數百個)的母種培養皿倒置於包有滅菌絲絨布的木質圓柱上，使其上沾滿來自培養皿平板上的菌落。然後可把這一“印章”的菌落一一接種到不同的選擇性培養基平板上。待這些平板培養後，對各平板相同位置上菌落作對比後，就可選出適當的突變型菌株。
(五)基因突變的機製
基因突變的原因是多種多樣的，它可以是自發的或誘發的。誘發的又可分為點突變和染色體畸變，它們還可進一步細分，具體如下。
1. 誘發突變
誘發突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學或生物因素顯著提高基因自發突變頻率的手段。凡具有誘變效應的任何因素，都可稱為誘變劑。
（1）堿基的置換：堿基置換可分為兩類：一類叫轉換，即DNA鏈中的一個嘌呤被另一個嘌呤或是一個嘧啶被另一個嘧啶所置換；另一類叫顛換，即一個嘌呤被另一個嘧啶或是一個嘧啶被另一個嘌呤所置換。
①直接引起置換的誘變劑：這是一類可直接與核酸的堿基發生化學反應的誘變劑，在體內或離體條件下均有作用，例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑等，後者包括硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N′-硝基-N -亞硝基胍（NTG）、乙烯亞胺、環氧乙酸、氮芥等。亞硝酸(HNO2)的作用機製主要是脫去堿基上的氨基，如A,C,G分別脫去氨基而成為H(次黃嘌呤),U(尿嘧啶)、X(黃嘌呤)等，複製時它們分別與C,A,C配對。原理是H(次黃嘌呤)有兩種異構體，一種是酮式，另一種是烯醇式，它們可分別與T及C配對結合，可以引起堿基對的轉換而造成突變，而且，AT→GC，GC→AT的轉換已經得到證實。由於X的分子結構隻能與C配對，而不能與T配對，所以，它不能引起GC→AT的堿基對轉換而造成突變。
②間接引起置換的誘變劑：它們都是一些堿基類似物，如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鳥嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)和6-氯嘌呤(6-CP)等，5-溴尿嘧啶（5-bromouracil,5-BU）它和T很相似，僅在第5個碳原子上由溴（Br）取代了T的甲基。5-BU有兩種異構體，一種是酮式，另一種是烯醇式，它們可分別與A及G配對結合，這樣在DNA複製中一旦摻入5-BU就會引起堿基的轉換而產生突變。5-BU一般以酮式狀態存在於DNA中，因而與A配對。5-BU很容易進行酮式與烯醇式結構的互變異構，當DNA複製時，烯醇式5-BU不與A而與G配對，從而造成AT→GC的轉換。其作用是通過活細胞的代謝活動摻入到DNA分子中而引起的，故是間接的。
（2）移碼突變：指誘變劑會使DNA序列中一個或少數幾個核苷酸發生增添(插入)或缺失，從而使該部位後麵的全部遺傳密碼發生轉錄和翻譯錯誤的一類突變。由移碼突變所產生的突變株，稱為移碼突變株。與染色體畸變相比，移碼突變隻能算是DNA分子的微小損傷。能引起移碼突變的因素是一些吖啶類染料，包括原黃素、吖啶黃、吖啶橙和α-氨基吖啶等。目前認為吖啶類化合物引起移碼突變的機製是因為它們都是一種平麵型三環分子，結構與一個嘌呤-嘧啶對十分相似，故能嵌入兩個相鄰DNA堿基對之間，造成雙螺旋的部分解開(兩個堿基對原來相距0.34nm，當嵌入一個吖啶分子後，即變成0.68 nm，從而在DNA複製過程中，使鏈上增添或缺失一個堿基，並引起了移碼突變。
（3）染色體畸變：某些強烈理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起上述的點突變外，還會引起DNA的大損傷——染色體畸變，既包括染色體結構上的缺失、重複、插入、易位和倒位，也包括染色體數目的變化。染色體畸變在高等生物中很容易觀察。在微生物中，尤其在原核生物中，近年來才證實了它的存在。許多理化誘變劑的誘變作用都不是單一功能的。例如，亞硝酸既能引起堿基的轉換作用，又能誘發染色體畸變。
2.自發突變
自發突變是指生物體在無人工幹預下自然發生的低頻率突變。隨誘變機製的研究，對自發突變的原因已有所認識，下麵討論幾種自發突變的可能機製。
(1) 背景輻射和環境因素的誘變 不少“自發突變”實質上是由一些原因不詳的低劑量誘變因素長期的綜合效應導致。例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、高溫的誘變效應以及自然界中普遍存在的一些低濃度的誘變物質的作用等。
(2) 微生物自身有害代謝產物的誘變 過氧化氫是普遍存在於微生物體內的一種代謝產物，它對脈孢菌具有誘變作用。這種作用可因同時加入過氧化氫酶而降低，如果同時再加入過氧化氫酶抑製劑，則又可提高突變率。這就說明，過氧化氫可能是自發突變中的一種內源誘變劑。在許多微生物的陳舊培養物中易出現自發突變株，可能也是同樣的原因。
(3)由DNA複製過程中堿基配對錯誤引起 據統計，DNA鏈每次複製中，每個堿基對錯誤配對的頻率是10-7～10-11，而一個基因平均約含1000 bp，故自發突變頻率約為10-6。因此，若對細菌做一般液體培養時，因其細胞濃度常可達到108個/ml，故經常會在其中產生自發突變株。
3. 紫外線對DNA的損傷及其修複
（1）紫外線誘變機理：在育種實踐中應用最方便最廣泛的物理誘變因素是紫外線。這種光線的波長稍短於可見光中的紫光，波長範圍從136-390nm。它是一種非電離輻射，能使被照射物質分子或原子中內層電子提高能級，但並不獲得或失去電子，所以不產生電離。紫外線誘變的最佳波長範圍是200-300nm，其中又以260nm左右最佳。紫外線的生物學效應主要在於它可引起DNA的變化。DNA強烈吸收紫外線，尤其是DNA鏈上的堿基對。對紫外線嘧啶比嘌呤敏感得多，幾乎要敏感100倍。紫外線引起DNA結構變化的形式很多，如DNA鏈斷裂、DNA分子內和分子間的交聯、核酸與蛋自質的交聯，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及嘧啶二聚體的形成，特別是後者。當DNA複製時，雙鏈須先變成單鏈，然後各自再與附近的堿基形成互補鏈，兩鏈之間嘧啶二聚體的交聯會阻礙雙鏈的分開和複製。同側鏈上相鄰胸腺嘧啶二聚體的形成，會阻礙堿基的正常配對。在正常情況下，胸腺嘧啶應與腺嘌呤配對，但兩個相鄰胸腺嘧啶的連接就可能改變這種情況，足以破壞腺嘌呤的正常摻入。複製會在這一點上突然停止或錯誤的進行。如新生成的DNA單鏈改變了的堿基順序，則在隨後的複製過成中，已改變的DNA鏈仍以自身為模板進行複製，進而產生了一個在兩條鏈上堿基順序都有錯誤的分子，其後果是基因突變。
（2）損傷的DNA修複作用：
A、光複活作用：把經UV照射後的微生物立即暴露於可見光下時，就可出現其死亡率明顯降低的現象，此即光複活作用。現已了解，經UV照射後帶有嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會被一種光激活酶——光解酶（光裂合酶）結合，這種複合物在300～500 nm可見光下時，此酶會因獲得光能而激活，並使二聚體重新分解成單體。與此同時，光解酶也從複合物中釋放出來，以便重新執行功能。由於一般的微生物中都存在著光複活作用，所以在利用UV進行誘變育種等工作時，就應在紅光下進行照射和後續操作，並放置在黑暗條件下培養。
B、切除修複：是活細胞內對被UV等誘變劑損傷後DNA的修複方式之一，又稱為暗修複，這是一種不依賴可見光，隻通過酶切作用去除嘧啶二聚體，隨後重新合成一段正常DNA鏈的核酸修複方式。在整個修複過程中，共有4種酶參與：①內切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5′-P側切開一個3′- OH和5′-P的單鏈缺口；②外切核酸酶從5′-P至3′-OH方向切除二聚體，並擴大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一條互補鏈為模板，從原有鏈上暴露的3′-OH端起逐個延長，重新合成一條缺失的DNA鏈；④通過連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3′-OH末端與原鏈的5′-P末端相連接，從而完成了修複作用。
C、重組修複作用：又稱為複製後修複，必須在DNA進行複製的情況下進行。重組修複可以在不切除胸腺嘧啶二聚體的情況下，以帶有二聚體的這一單鏈為模板而合成互補單鏈，可是在每一個二聚體附近留下一個空隙。一般認為通過染色體交換，空隙部位就不再麵對著胸腺嘧啶二聚體而麵對著正常的單鏈，在這種情況下DNA多聚酶和連接酶便能起作用而把空隙部分進行修複。
D、緊急呼救（SOS）修複係統：這是細胞經誘導產生的一種修複係統。它的修複功能依賴於某些蛋白質的誘導合成，但這些蛋白質是不穩定的。SOS修複功能和細菌的一係列生理活動有關，如細胞的分裂抑製、引起DNA損傷的因素和抑製DNA複製的許多因素都能引起SOS反應。
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