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工業微生物菌種的選育——抗噬菌體菌株的篩選



錄入時間:2010-8-12 9:16:35 來源:青島betway必威西汉姆联

      在工業微生物發酵過程中,出現噬菌體以後必須選育抗噬菌體菌株和配合其他措施使生產繼續進行。既要不斷收集噬菌體,又要不斷選育新的抗性菌株,以確保生產正常進行。
 
細菌的抗性是基因突變的結果,抗噬菌體突變可以發生在接觸噬菌體以前,它和噬菌體的存在與否無關。
1、抗噬菌體菌株選育的方法
    根據基因突變規律,可采用自然突變和誘發突變等方法獲得。
(1)自然突變 以噬菌體為篩子,敏感菌株的孢子不經任何誘變由其自然突變為抗性菌株,這種方法獲得的抗性突變頻率很低。
(2)誘發突變 敏感菌株先經誘變因素處理,然後將處理過的孢子液分離在含有高濃度的噬菌體的平板培養基上,經誘變後的存活孢子中,如存在抗性變異菌株就能在此平板上生長。這種菌落生長的速度一般與正常菌落的生長速度相近,誘變可以提高抗性菌株的頻率。
 
2、抗噬菌體菌株選育的程序
   (1)專一性噬菌體獲得和純化
選育抗噬菌體菌株需要相應專一性噬菌體作為選擇因子。首先要分離獲得噬菌體,並且加以純化,然後設法製備高濃度的噬菌體原液。
具體做法:在培養皿上挑取被噬菌體侵染後形成的噬菌斑,移接到含有1%蛋白腖培養液(pH7.0)中培養,然後用重層法連續多次進行分離,直至出現的噬菌斑形狀、大小基本一致,說明性的噬菌體得到了純化。
(2)高效價噬菌體原液的製備
將已純化的噬菌體移接到已培養7—8h處於對數期的敏感菌培養液中,繼續培養10h左右,此時已有較多噬菌體釋放。將培養液離心,取含有噬菌體的上清液,再次移接到處於對數期的宿主菌培養液中,適溫培養一定時間,待噬菌體大量釋放,用細菌過濾器過濾,可以得到高效價噬菌體原液。
(3)噬菌體原液效價測定
原液濃度以效價作為指標。測定噬菌體效價的方法:用含有1%蛋白腖溶液作為稀釋劑,按常規法稀釋到10-7--10-8,采用重層瓊脂法進行定量測定,要重複3-5個平皿。噬菌體原液效價要求達到1010--1011U/ml,保存備用。
(4)菌株誘發突變和分離
與常規誘變育種相同。用理化因子處理宿主菌,以提高抗性突變體的頻率。然後把懸浮液分離在含有噬菌體的平皿上,經培養後,如果出現菌落,注意挑選些生長速度與正常菌落相差無幾的菌落移接到斜麵培養,這些菌落可能具有不程度的抗性。進一步複證抗噬菌體的能力。此後在噬菌體存在條件下還要通過體培養,觀察菌體生長及發酵產物積累情況。
(5)液體搖瓶振蕩培養
從平皿上經過初步篩選的抗性菌株,進一步在搖瓶中進行沉沒培養。在一定溫度下,培養到對數期(若絲狀菌,孢子萌發後長成菌絲體),加入一定量高效(1010一1011U/m1)噬菌體原液。繼續培養、觀察菌體消失,而後又重新再生。此時,將再生菌體移入到新的培養基中,繼續培養到對數期,加入高效價噬菌體原液再培養。如此反複3—4次,然後分離在含有噬菌體的平皿上,挑取生長速度快單菌落移入斜麵,並在斜麵上滴加噬菌體原液,經培養後,觀察滴加原液處菌苔生長情況。選取生長正常的菌苔,再進行搖瓶複篩。經觀察和測定,選取生長正常酶活力或產物產量高的菌株,保存,供特性試驗等。
(6)進一步考查抗性菌株對周圍環境中存在的各種噬菌體的抗性
 
3、抗噬菌體菌株特性研究
無論從自然突變或誘發突變所得到的抗噬菌體菌株,在用於生產之前,均需經過反複驗證,才能使用。
(l)抗噬菌體性狀的穩定性試驗
 抗性菌株分別在孢子培養、種子培養和發酵培養過程中用點滴法或雙層瓊脂法測定噬菌斑。如都不出現噬菌斑,說明該菌株對此噬菌體具有抗性。此外,還可以觀察抗性菌株經多次傳代後對噬菌體的抗性是否穩定。
(2)抗性菌株的產量試驗
在選育抗噬菌體菌株時,既要求具有抗性,同時亦要求生產能力不低於原敏感菌株。
(3)真抗性與溶源性的區別試驗
菌株的抗噬菌體特性具有遺傳的相對穩定性。抗性表現力多種多樣,可因細胞壁結構的改變而阻止噬菌體吸附侵入,也可因生理代謝的改變,使噬菌體不能侵染,即使侵染後也不能增殖釋放。這些菌株都具有真正的抗性。溶原性菌株則因細胞中存在原噬菌體,對同一類型噬菌體具有免疫性。表麵上看來,這種菌株具有抗性,但可采用物理、化學因素誘導不同的敏感菌看它是否會釋放噬菌體。出現噬菌斑的菌株就是溶源菌,而不是真正抗性菌。
 

 

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