代謝調控及育種

     從工業微生物育種史來看，誘變育種曾取得了巨大的成就，使微生物有效產物成百倍、乃致成千倍的增加。但是誘變育種工作量繁重，盲目性大。近年來由於應用生物化學和遺傳學原理，深入研究了生物合成代謝途徑以及代謝調節控製的基礎理論，人們不僅可進行外因控製，通過培養條件來解除反饋調節而使生物合成的途徑朝著人們所希望的方向進行，即實現代謝控製發酵；同時還可進行內因改變，通過定向選育某種特定的突變型，以達到大量積累有益產物的目的，即所謂代謝控製育種。內因是變化的根據，所以改變微生物的遺傳型往往是控製代謝的更為有效的途徑。代謝控製育種可以大大減少傳統育種的盲目性，提高了效率。代謝控製育種很快在初級代謝產物的育種中得到廣泛的應用，成就也十分顯赫，幾乎全部氨基酸和多種核苷酸生產菌株都被打上了抗性或缺陷型遺傳標記。

     代謝調節控製育種通過特定突變型的選育，達到改變代謝通路、降低支路代謝終產物的產生或切斷支路代謝途徑及提高細胞膜的透性，使代謝流向目的產物積累方向進行。

 

克服反饋調節，可從以下兩方麵著手：降低末端產物濃度；應用抗反饋突變株

 

營養缺陷型突變株的代謝流受阻，末端產物減少，解除了末端產物參與的反饋調節，可使代謝途徑中的某一中間產物積累。一個典型的例子是穀氨酸棒狀杆菌的精氨酸缺陷型突變株進行鳥氨酸發酵(，由於合成途徑中酶6(氨基酸甲酰轉移酶)的缺陷，必須供應精氨酸和瓜氨酸，菌株才能生長，但是這種供應要維持在亞適量水平，使菌體達到最高生長，又不引起終產物對酶② (N—乙酰穀氨酸激酶)的反饋抑製，從而使鳥氨酸得以大量分泌累積。

 

營養缺陷型突變導致協同反饋調節某一分支途徑的代謝阻斷，使這一分支途徑的終產物不能合成。若控製供應適量的這一終產物，滿足微生物生長，將使合成代謝流向另一分支途徑，有利於另一終產物的大量積累。例如，穀氨酸棒杆菌生物素缺陷型是以葡萄糖或醋酸作為碳源，棒狀杆菌經誘變處理後，基因發生突變，不能合成相應的酶，導致乙酰輔酶A和生物素之間的合成反應受到阻斷，切斷了支路代謝，代謝隻能向著穀氨酸合成方向進行，因而產量得到累積。又如硫胺素缺陷型是在α-酮戊二酸與硫胺素之間的反應發生阻斷，也使穀氨酸產量大幅度增加。又如次黃嘌呤核苷酸產生菌，是棒杆菌和短杆菌的腺嘌呤缺陷型菌株，其合成途徑中酶③失活，控製限量補給腺核苷酸，可解除腺核苷對酶①的反饋調節，由於腺核苷酸和鳥核苷酸對酶①協同反饋調節，故代謝流偏向鳥苷酸這一分支途徑

 

工業上應用的重要例子是賴氨酸發酵。我國工業生產賴氨酸曾是一株高絲氨酸缺陷型菌株，由生產穀氨酸北京棒狀杆菌ASl．299ASl 299經硫酸二乙酯處理後獲得的。從圖8．24可知，蘇氨酸、高絲氨酸、

賴氨酸的前體是天冬氨酰半縮醛，誘變後，促使高絲氨酸脫氫酶的基因發生突變，導致合成高絲氨酸的代謝途徑阻斷，消除了蘇氨酸和賴氨酸天冬氨酰激酶的協同反饋抑製，因而天冬酰半縮醛由原來負責合成3個氨基酸而代謝流完全導向賴氨酸方向進行，使賴氨酸產量大量累積。

 

滲漏缺陷型是一種不完全營養缺陷型，它不會產生過量的末端產物，因而可以避開反饋調節。但它又能合成微量的末端產物，用來進行生物合成；在培養這種突變體時，可不必在培養基中添加相應的物質，就能積累所需的產物。

 

細胞內合成的發酵產物若要分泌到培養基中，必須經過細胞膜和細胞壁。如果產物不易分泌出細胞，而積累在細胞內，則會引起反饋調節。改變細胞膜和細胞壁的通透性，使其有利於產物的分泌，也是降低末端產物濃度的一種途徑。穀氨酸生產菌的細胞膜磷脂含量高時，細胞的通透性較差，磷脂含量低時，通透性較好。

 

在以積累末端產物為目的的發酵生產中，如果代謝途徑單一無分支，往往不能選用營養缺陷型突變株。要提高產量，最好采用抗反饋突變株。抗反饋突變株由於基因突變，它們的酶或無活性的原阻遏物不再與末端產物結合，從而不再發生酶的變構及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再與發生了突變的操縱基因結合，因此反饋調節被打破，即使在末端產物過量的情況下，也同樣可以積累高濃度的末端產物。

 

抗反饋突變株通常可以用添加末端產物類似物的方法來篩選。末端產物類似物和末端產物結構類似，因而能夠引起反饋，但是它們不能參與生物合成。在培養基中添加末端產物類似物後，未突變的細胞將由於代謝途徑受阻而不能獲得生物合成所需的該種末端產物，從而導致細胞死亡。那些對類似物不敏感的突變體，則由於原來受反饋控製的酶的結構，或是酶的合成係統已經發生了改變，它們不再受抑製或阻遏的影響，在類似物充斥的情況下照常能合成該種末端產物。例如，用類似物D-精氨酸選出的穀氨酸棒杆菌的抗反饋突變株可使L-精氨酸的產量得到提高。

 

生產中要克服分解代謝阻遏可采取下列措施：

可采用相對來說不引起分解代謝阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有機酸和黃豆餅粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培養熒光假單胞菌，由於克服了半乳糖的分解代謝阻遏，結果在細胞中所產生的纖維素酶提高了1500倍。

 

在考慮經濟效益而必須使用有阻遏作用的碳源或氮源時，緩慢流加碳、氮源可使分解代謝產物維持在較低的水平上，而不至於產生阻遏。

 

篩選方法：在以酶受阻遏的底物為唯一氮源的培養基上，選擇能正常生長的菌落。

 

在生產上為了提高誘導酶的產量，對誘導調節控製的常用手段有：

 

1、添加誘導物類似物：在誘導物就是酶的底物的情況下，添加底物類似物來加強誘導作用是最好的。因為底物類似物不易被所形成的酶分解，而在細胞中始終保持較高的濃度，能夠持續地誘導酶的合成，獲得較高濃度的酶。

2、添加輔酶或輔助因子：在有些情況下，必須在培養基中添加輔酶才會產生誘導作用。例如：丙酮酸脫羧酶的合成需有硫胺存在。

3、利用組成型突變株：選育組成型突變株的方法，其主要原則是創造一種利於組成型菌株生長而不利於誘導型菌株生長的培養條件，造成對組成型的選擇優勢以及適當的識別兩類菌落的方法，從而把組成型突變株選擇出來。