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發酵工藝控製——氧對發酵的影響及控製



錄入時間:2010-8-13 9:26:18 來源:青島betway必威西汉姆联《微生物工程》

    在好氧深層培養中,氧氣的供應往往是發酵能否成功的重要限製因素之一。通氣效率的改進可減少空氣的使用量,從而減少泡沫的形成和雜菌汙染的機會
 
一、溶解氧對發酵的影響
    溶氧是需氧發酵控製最重要的參數之一。由於氧在水中的溶解度很小,在發酵液中的溶解度亦如此,因此,需要不斷通風和攪拌,才能滿足不同發酵過程對氧的需求。溶氧的大小對菌體生長和產物的形成及產量都會產生不同的影響。如穀氨酸發酵,供氧不足時,穀氨酸積累就會明顯降低,產生大量乳酸和琥珀酸。
   
     需氧發酵並不是溶氧愈大愈好。溶氧高雖然有利於菌體生長和產物合成,但溶氧太大有時反而抑製產物的形成。因為,為避免發酵處於限氧條件下,需要考查每一種發酵產物的臨界氧濃度和最適氧濃度,並使發酵過程保持在最適濃度。最適溶氧濃度的大小與菌體和產物合成代謝的特性有關,這是由實驗來確定的。根據發酵需氧要求不同可分為三類:第一類有穀氨酸、穀氨酰胺、精氨酸和脯氨酸等穀氨酸係氨基酸,它們在菌體呼吸充足的條件下,產量才最大,如果供氧不足,氨基酸合成就會受到強烈的抑製,大量積累乳酸和琥珀酸;第二類,包括異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸,即天冬氨酸係氨基酸供氧充足可得最高產量,但供氧受限,產量受影響並不明顯;第三類,有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸,僅在供氧受限、細胞呼吸受抑製時,才能獲得最大量的氨基酸,如果供氧充足,產物形成反而受到抑製
 
    氨基酸合成的需氧程度產生上述差別的原因,是由它們的生物合成途徑不同所引起的,不同的代謝途徑產生不同數量的NAD(P)H,當然再氧化所需要的溶氧量也不同。第一類氨基酸是經過乙醛酸循環和磷酸烯醇式丙酮酸羧化係統兩個途徑形成的,產生的NADH量最多。因此NADH氧化再生的需氧量為最多,供氧愈多,合成氨基酸當然亦愈順利。第二類的合成途徑是產生NADH的乙醛酸循環或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮酸羧化係統,產生的NADH量不多,因而與供氧量關係不明顯。第三類,如苯丙氨酸的合成,並不經TCA循環,NADH產量很少,過量供氧,反而起到抑製作用。肌苷發酵也有類似的結果。由此可知,供氧大小是與產物的生物合成途徑有關
    在抗生素發酵過程中,菌體的生長階段和產物合成階段都有一個臨界氧濃度,分別為C臨′和C臨〞。兩者的關係有:①大致相同;②C臨′﹥C臨〞③C臨′﹤C臨〞。
 
二、微生物對氧的需求
    好氧微生物生長和代謝均需要氧氣,因此供氧必須滿足微生物在不同階段的需要,在不同的環境條件下,各種不同的微生物的吸氧量或呼吸強度是不同的。
微生物的吸氧量常用呼吸強度和攝氧率兩種方法來表示,呼吸強度是指單位質量的幹菌體在單位時間內所吸取的氧量,以QO2,表示,單位為mmolO2/(g幹菌體•h)。當氧成為限製性條件時,比耗氧速率為:
QO2=(QO2)mCL/(K0+CL)
(QO2)m --------最大比耗氧速度,mol /(kg.s)
K0 --------氧的米氏常數,mol /m3
CL---------- 溶解氧的濃度, mol /m3
 
攝氧率是指單位體積培養液在單位時間內的耗氧量,以r表示,單位為mmolO2/(L•h)。呼吸強度可以表示微生物的相對吸氧量,但是,當培養液中有固體成分存在時,對測定有困難,這時可用攝氧率來表示。微生物在發酵過程中的攝氧率取決於微生物的呼吸強度和單位體積菌體濃度。
 
微生物的比耗氧速率的大小受多種因素影響,當培養基中不存在其他限製性基質時,比耗氧速率隨溶氧濃度增加而增加,直至某一點,比耗氧速率不再隨溶氧濃度的增加而增加,此時的溶氧濃度稱為呼吸臨界氧濃度(criticaloxygenconcentrationOf respiration),以Ccr表示。呼吸臨界溶氧濃度一般指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度,如對產物形成而言便稱為產物合成的呼吸臨界氧濃度。
 
    當不存在其他限製性基質時,溶解氧濃度高於臨界值,細胞的比耗氧速率保持恒定;在臨界氧濃度以下,微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降,細胞處於半厭氣狀態,代謝活動受到阻礙。培養液中維持微生物呼吸和代謝所需的氧保持供氧與耗氧的平衡,才能滿足微生物對氧的利用。
由此可知,隻有使溶氧濃度大於其臨界氧濃度時,才能維持菌體的最大的比耗氧速率,以使菌體得到最大的合成量。但由於發酵的目的是為了得到發酵的產物,因此,由氧饑餓而引起的細胞代謝幹擾,可能對形成某些產物是有利的。所以,需氧發酵並不是溶氧愈大愈好。即使是一些專性好氧菌,過高的溶氧對生長可能不利。氧的有害作用是通過形成新生O,超氧化物基O2-和過氧化物基O22-或羥基自由基OH-,破壞許多細胞組分體現的。有些帶巰基的酶對高濃度的氧敏感,好氣微生物曾發展一些機製,如形成觸酶,過氧化物酶和超氧化物歧化酶,使其免遭氧的摧毀。溶氧高雖然有利於菌體生長和產物合成,溶氧太大有時反而抑製產物的形成。為避免發酵處於限氧條件下,需要考查每一種發酵產物的臨界氧濃度和最適氧濃度,並使發酵過程保持在最適濃度。最適濃度的大小與菌體和產物合成代謝的特性有關,這是由實驗來確定的。發酵生產中,供氧的多少應根據不同的菌種、發酵條件和發酵階段等具體情況決定。
 
    例如穀氨酸發酵在菌體生長期,希望糖的消耗最大限度地用於合成菌體,而在穀氨酸生成期,則希望糖的消耗最大限度地用於合成穀氨酸。因此,在菌體生長期,供氧必須滿足菌體呼吸的需氧量,即r=Qo2c(X),若菌體的需氧量得不到滿足,則菌體呼吸受到抑製,而抑製生長,引起乳酸等副產物的積累,菌體收率降低。但是供氧並非越大越好,當供氧滿足菌體需要,菌體的生長速率達最大值,如果再提高供氧,不但不能促進生長,造成浪費,而且由於高氧水平抑製生長。同時高氧水平下生長的菌體不能有效地產生穀氨酸。
 
三、影響微生物需氧量的因素   
    在需氧微生物發酵過程中影響微生物需氧量的因素很多,除了和菌體本身的遺轉特性有關外,還和下列一些因素有關:
 
1.培養基
培養基的成分和濃度對產生菌的需氧量的影響是顯著的。培養基中碳源的種類和濃度對微生物的需氧量的影響尤其顯著。一般來說,碳源在一定範圍內,需氧量隨碳源濃度的增加而增加。在補料分批發酵過程中,菌種的需氧量隨補入的碳源濃度而變化,一般補料後,攝氧率均呈現不同程度的增大
 
2、菌齡及細胞濃度
    不同的生產菌種,其需氧量各異。同一菌種的不同生長階段,其需氧量也不同。—般說,菌體處於對數生長階段的呼吸強度較高,生長階段的攝氧率大於產物合成期的攝氧率。在分批發酵過程中,攝氧率在對數期後期達到最大值。因此認為培養液的攝氧率達最高時,表明培養液中菌體濃度達到了最大值。
 
3、培養液中溶解氧濃度的影響
在發酵過程中,培養液中的溶解氧濃度(CL)高於菌體生長的臨界氧濃度(C長臨)時,菌體的呼吸就不受影響,菌體的各種代謝活動不受幹擾;如果培養液中的CL低於C長臨時,菌體的多種生化代謝就要受到影響,嚴重時會產生不可逆的抑製菌體生長和產物合成的現象。
 
4、培養條件 
若幹實驗表明,微生物呼吸強度的臨界值除受到培養基組成的影響外,還與培養液的pH、溫度等培養條件相關。一般說,溫度愈高,營養成分愈豐富,其呼吸強度的臨界值也相應增高。
 
5、有毒產物的形成及積累
    在發酵過程中,有時會產生一些對菌體生長有毒性的如CO2等代謝產物,如不能及時從培養液中排除,勢必影響菌體的呼吸,進而影響菌體的代謝活動。
 
6、揮發性中間產物的損失
在糖代謝過程中,有時會產生一些揮發性的有機酸,它們隨著大量通氣而損失,從而影響菌體的呼吸代謝。
 
四、氧在發酵液中的傳遞
1、氧的傳遞阻力
在需氧發酵過程中,氣態氧必須先溶解於培養基中,然後才可能傳遞至細胞表麵,再經過簡單的擴散作用進入細胞內的呼吸酶的位置上而被利用,參與菌體內的氧化等生物化學反應。氧的這一係列傳遞過程需要克服供氧方麵和需氧方麵的各種阻力才能完成。
 
2、氧的傳遞方程式
(1)雙膜理論
微生物發酵中,通入發酵罐內的空氣中含有的氧不斷溶解於培養液中,以供菌體細胞代謝之需。氧從氣相傳遞到液相,是氣一液相間氧的傳遞過程,在這一傳遞過程中,氣液界麵的阻力1/KI可以忽略,液體主流中的傳遞阻力1/KLB很小也可忽略,此時主要的傳遞阻力存在於氣膜和液膜中。對於這種傳遞過程的描述,應用最廣的是雙膜理論。
這個理論假定在氣泡和包圍著氣泡的液體之間存在著界麵,在界麵的氣泡一側存在著一層氣膜,在界麵液體一側存在著一層液膜,氣膜內的氣體分子與液膜中的液體分子都處於層流狀態,分子之間無對流運動,因此氧分子隻能以擴散方式,即借助於濃度差而透過雙膜,另外,氣泡內除氣膜以外的氣體分子處於對流狀態,稱為氣流主體,在空氣主流空間的任一點氧分子的濃度相同,液流主體亦如此。
(一)影響氧傳質推動力的因素
要想增加氧傳遞的推動力(C*一CL),就必須設法提高C*或降低CL。
1、提高飽和溶氧濃度C*的方法
A、溫度:降低溫度
B、溶液的性質:一般來說,發酵液中溶質含量越高,氧的溶解度越小。
C、氧分壓:在係統總壓力小於0.5MPa時,氧在溶液中的溶解度隻與氧的分壓成直線關係。氣相中氧濃度增加,溶液中氧濃度也增加。
想提高C*就得降低培養溫度或降低培養基中營養物質的含量,或提高發酵罐內的氧分壓(即提高罐壓)。這幾種方法的實施均有較大的局限性。已知發酵培養基的組成和培養濃度是依據生產菌種的生理特性和生物合成代謝產物的需要而確定的,不可任意改動。但有時分批發酵的中後期,由於發酵液粘度太大,補入部分滅菌水來降低發酵液的表觀粘度,改善通氣效果。采用提高氧分壓的方法,一是提高發酵罐壓力,二是向發酵液通入純氧氣。提高罐壓會減小氣泡體積,減少了氣—液接觸麵積,影響氧的傳遞速率,降低氧的溶解度。影響菌體的呼吸強度,同時增加設備負擔。通人純氧能顯著提高CL,但此利方法既不經濟又不安全,同時易出現微生物的氧中毒現象。
 
(2)、降低發酵液中的CL
降低發酵液中的CL,可采取減少通氣量或降低攪拌轉速等方式來降低KLa,使發酵液中的CL降低。但是,發酵過程中發酵液中的CL不能低於C臨界,否則就會影響微生物的呼吸。目前發酵所采用的設備,其供氧能力已成為限製許多產物合成的主要因素之一,故此種方法亦不理想。
 
(二)、影響液相體積氧傳遞係數KLa的因素
經過長時間的研究和生產實踐證實,影響發酵設備的KLa的主要因素有攪拌效率、空氣流速、發酵液的物理化學性質、泡沫狀態、空氣分布器形狀和發酵罐的結構等。實驗測出的KLa與攪拌效率、通氣速度、發酵液理化性質等的關係可用下述的經驗式表示:
    KLa=K〔 (P/V)α 〕.(VS)βapp))  
式中  P/V——單位體積發酵液實際消耗的功率(指通氣情況下,kW/m3);
  VS——空氣直線速度,m/h;
ηapp——發酵液表觀粘度,(kg·s)/m’;
α、β、ω——指數,與攪拌器和空氣分布器的形式等有關。
  K——經驗常數。
 
1、攪拌效率對KLa的影響
發酵罐內裝配攪拌器的作用有:①使發酵罐內的溫度和營養物質濃度均一,使組成發酵液的三相係統充分混合;②把引入發酵液中的空氣分散成小氣泡,增加了氣—液接觸麵積,提高KLa值;⑧強化發酵液的湍流程度,降低氣泡周圍的液膜厚度和湍流中的流體的阻力,從而提高氧的轉移速率;④減少菌絲結團,降低細胞壁周圍的液膜阻力,有利於菌體對氧的吸收,同時可盡快排除細胞代謝產生的“廢氣”和“廢物”,有利於細胞的代謝活動。應提出的是如果攪拌速度快,由於剪切速度增大,茵絲體會受到損傷,影響菌絲體的正常代謝,同時浪費能源。
 
2、空氣流速
KLa隨空氣流速的增加而增加,指數β約為0.4~0.72,隨攪拌器形式而異。但當空氣流速過大時,攪拌器就出現“氣泛”現象,KLa不再增加。“氣泛”現象指的是在特定條件下,通人發酵罐內的空氣流速達某一值時,使攪拌功率下降,
當空氣流速再增加時,攪拌功率不再下降,此時的空氣流速稱為“氣泛點”(Floodingpoint)。帶攪拌器的發酵罐的氣泛點,主要與攪拌葉的形式、攪拌器的直徑和轉速、空氣線速度等相關。
對一定設備而言,空氣流速與空氣流量之間呈正相關性。空氣流量的改變必然引起空氣流速的變化。已知空氣流速的變化會引起體積氧傳遞係數KLa的改變,當空氣流速達氣泛點時,KLa不再增加。這樣,空氣流量的變化也會改變KLa,當空氣流量達某一值時,KLa也不再增加,如圖7-5所示。所以,在發酵過程中應控製空氣流速(或流量),使攪拌軸附近的液麵處沒有大氣泡逸出。
 
攪拌功率和空氣流速對KLa的影響,實驗測出攪拌功率對抗生素產率的影響遠大於空氣流速。高攪拌轉速,不僅使通人罐內的空氣得以充分的分散,增加氣—液接觸麵積,而且還可以延長空氣在罐內的停留時間。空流速過大,不利於空氣在罐內的分散與停留,同時導致發酵液濃縮,影響氧的傳遞。但空氣流速過低,因代謝產生的廢氣不能及時排除等原因,也會影響氧的傳遞。因此,要提高發酵罐的供氧能力,采用提高攪拌功率,適當降低空氣流速,是一種有效的方法。
 
3、發酵液理化性質的影響
KLa與發酵液的表觀粘度ηapp呈反比。說明發酵液的流變學性質是影響KLa的主要因素之一。發酵液是由營養物質、生長的菌體細胞和代謝產物組成的。由於微生物的生長和多種代謝作用使發酵液的組成不斷地發生變化,營養物質的消耗、菌體濃度、菌絲形態和某些代謝產物的合成都能引起發酵液粘度的變化,致使發酵過程中的發酵液呈現多種流變學性質。
 
以澱粉作碳源的培養基屬於非牛頓型流體,在發酵過程中,隨著微生物的生長和代謝作用,其流變學性質不斷變化。如生產金黴素時,以澱粉作碳源,接種時,培養基呈平漢塑性流體性質,發酵至22小時,由於微生物的代謝作用,發酵液粘度降至很低(低於18Pa·s),呈現牛頓型流體性質。22小時起由於菌絲體濃度不斷增加,則發酵液粘度逐漸增大,直至粘度達90Pa·s、表現為漲塑性流體的性質。
 
發酵過程中菌體濃度和形態在氧的傳遞速率方麵顯示一定影響。許多細菌和酵母菌發酵時,發酵液粘度低,呈現牛頓型流體性質,對氧的轉移沒有什麽影響。黴菌和放線菌發酵液多數時間屬於非牛頓型流體,粘度較大,對氧的轉移有較大影響。在單細胞和絲狀菌發酵中,對數生長期兩者的氧吸收速率是相同的,但在溶解氧濃度受到限製的條件下,達到平衡期,單細胞發酵液的氧吸收速率無變化,而絲狀菌發酵液的氧吸收速率卻顯著下降,其原因是絲狀菌發酵液的菌體濃度增加,使發酵液粘度不斷增大,致使KLa值降低,進而導致菌體的氧吸收速率下降。在青黴素發酵中,由於菌絲體濃度的不斷增加,使發酵液粘度不斷增大,KLa卻隨之下降。
 
在沉沒培養過程中,由於攪拌的作用,有的菌體(尤其是黴菌)形成不連續的球狀體,有的形成交替的絲狀體。一般說,球狀體發酵液粘度低,呈現牛頓型流體性質,而絲狀體會大大增加發酵液的粘度,呈現非牛頓型流體性質。攪拌強度影響菌體形態,高剪切速率可減少菌絲團的形成,如青黴素發酵中,高攪拌速度易使菌體產生分枝菌絲,低攪拌速度易使菌體形成菌絲團或長成長菌絲。
一般說,微生物生物合成的代謝產物對發酵液的流變學性質的影響相對說是較小的。
 
4、泡沫的影響
在發酵過程中,由於通氣和攪拌而引起發酵液出現泡沫。如果在較稠厚的發酵液中形成流態性泡沫時,是難以消除的,其中的氣體就很難得到及時的更新,直接影響微生物的呼吸。如果攪拌葉輪處於泡沫的包圍之中,就會影咆氣液體的充分混合,降低氧的傳遞速率。用消沫劑可以消除泡沫,改善氣液體混合效果,提高氧的傳遞速率。但過多的消沫劑會聚集於細胞表麵上,阻礙菌體對氧和營養物質的吸收。因此,消沫劑的用量應控製。
 
5、空氣分布器形式和發酵罐結構的影響
在需氧發酵中,除用攪拌將空氣分散成小氣泡外,還可用鼓泡器來分散空氣,提高通氣效率。研究指出,大型環狀鼓泡器的直徑大於攪拌器直徑時,大量的空氣未經攪拌器的分散而沿罐壁逸出液麵,其空氣分散效果很差。所以環型鼓泡器的直徑一定要小於攪拌器的直徑。關於多孔環狀鼓泡器和單孔式鼓泡器的通氣效果,有的試驗表明,當空氣流量達到一定值時,單孔式鼓泡器的效果不比多孔環狀鼓泡器的效果差。因為在裝配有攪拌器的發酵罐中,空氣的分散主要依靠攪拌的作用。所以當空氣流量增大時,單孔式鼓泡器能增強發酵液的湍流程度。當前的生產實踐,發酵罐內空氣分布器絕大多數采用多孔環型鼓泡器5。
 
為了彌補一般空氣攪拌罐的通氣效率的不足,有人在設備上做些相應的改進,當增加發酵罐的高度,以求增加氣—液接觸時間,提高氧的溶解度。

 

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