雜菌汙染的途徑和防治

 

由於種子帶菌而發生的染菌率雖然不高，但它是發酵前期染菌的重要原因之一，是發酵生產成敗的關鍵，因而對種子染菌的檢查和染菌的防治是極為重要的。種子帶菌的原因主要有保藏的斜麵試管菌種染菌、培養基和器具滅菌不徹底、種子轉移和接種過程染菌以及種子培養所涉及的設備和裝置染菌等。針對上述染菌原因，生產上常用以下的一些措施予以防治。

 

①嚴格控製無菌室的汙染，根據生產工藝的要求和特點，建立相應的無菌室，交替使用各種滅菌手段對無菌室進行處理。除常用的紫外線殺菌外，如發現無菌室已汙染較多的細菌，可采用石碳酸或土黴素等進行滅菌；如發現無菌室有較多的黴菌，則可采用製黴菌素等進行滅菌；如果汙染噬菌體，通常就用甲醛、雙氧水或高錳酸鉀等滅菌劑進行處理。

②在製備種子時對沙土管、斜麵、三角瓶及搖瓶均嚴格進行管理，防止雜菌的進入而受到汙染。為了防止染菌，種子保存管的棉花塞應有一定的緊密度，且有一定的長度，保存溫度盡量保持相對穩定，不宜有太大變化。

③對每一級種子的培養物均應進行嚴格的無菌檢查，確保任何一級種子均未受雜菌感染後才能使用。

④對菌種培養基或器具進行嚴格的滅菌處理，保證在利用滅菌鍋進行滅菌前，先完全排除鍋內的空氣，以免造成假壓，使滅菌的溫度達不到預定值，造成滅菌不徹底而使種子染菌。

 

二、空氣帶菌及其防治    

 

無菌空氣帶菌是發酵染菌的主要原因之一。要杜絕無菌空氣帶菌，就必須從空氣的淨化工藝和設備的設計、過濾介質的選用和裝填、過濾介質的滅菌和管理等方麵完善空氣淨化係統。

加強生產環境的衛生管理，減少生產環境中空氣的含菌量，正確選擇采氣口，如提高采氣口的位置或前置粗過濾器，加強空氣壓縮前的預處理，如提高空壓機進口空氣的潔淨度。

 

設計合理的空氣預處理工藝，盡可能減少生產環境中空氣帶油、水量，提高進入過濾器的空氣溫度，降低空氣的相對濕度，保持過濾介質的幹燥狀態，防止空氣冷卻器漏水，防止冷卻水進入空氣係統等。

 

設計和安裝合理的空氣過濾器，防止過濾器失效。選用除菌效率高的過濾介質，在過濾器滅菌時要防止過濾介質被衝翻而造成短路，避免過濾介質烤焦或著火，防止過濾介質的裝填不均而使空氣走短路，保證一定的介質充填密度。當突然停止進空氣時，要防止發酵液倒流人空氣過濾器，在操作過程中要防止空氣壓力的劇變和流速的急增。

 

一般來說，稀薄的培養基比較容易滅菌徹底，而澱粉質原料，在升溫過快或混合不均勻時容易結塊，使團塊中心部位“夾生”，蒸汽不易進入將雜菌殺死，但在發酵過程中這些團塊會散開，而造成染菌。同樣由於培養基中諸如麩皮、黃豆餅一類的固形物含量較多，在投料時濺到罐壁或罐內的各種支架上，容易形成堆積，這些堆積物在滅菌過程由於傳熱較慢，一些雜菌也不易被殺滅，一旦滅菌操作完成後，通過冷卻、攪拌、接種等操作，含有雜菌的堆積物將重新返回培養液中，造成染菌。通常對於澱粉質培養基的滅菌采用實罐滅菌較好，一般在升溫前先通過攪拌混合均勻，並加入一定量的澱粉酶進行液化；有大顆粒存在時應先經過篩除去，再行滅菌；對於麩皮、黃豆餅一類的固形物含量較多的培養基，采用罐外預先配料，再轉至發酵罐內進行實罐滅菌較為有效。

 

滅菌時由於操作不合理，未將罐內的空氣完全排除，造成壓力表顯示“假壓”，使罐內溫度與壓力表指示的不對應，培養基的溫度以及罐頂局部空間的溫度達不到滅菌的要求，導致滅菌不徹底而染菌。因此，在滅菌升溫時，要打開排氣閥門，使蒸汽能通過並驅除罐內冷空氣，一般可避免此類染菌。

培養基在滅菌過程中很容易產生泡沫，發泡嚴重時泡沫可上升至罐頂甚至逃逸，以致泡沫頂罐，雜菌很容易藏在泡沫中，由於泡沫的薄膜及泡沫內的空氣傳熱差，使泡沫內的溫度低於滅菌溫度，一旦滅菌操作完畢並進行冷卻時，這些泡沫就會破裂，雜菌就會釋放到培養基中，造成染菌。因此，要嚴防泡沫升頂，盡可能添加消泡劑防止泡沫的大量產生。

 

在連續滅菌過程中，培養基滅菌的溫度及其停留時間必須符合滅菌的要求，尤其是在滅菌結束前的最後一部分培養基也要善始善終，以確保徹底滅菌。避免蒸汽壓力的波動過大，應嚴格控製滅菌的溫度，過程最好采用．9動控溫。

 

發酵過程中越來越多地采用了自動控製，一些控製儀器逐漸被應用。如用於連續測定並控製發酵液pH值的複合玻璃電極、測定溶氧濃度的探頭等，這些探頭或元件如用蒸汽進行滅菌，不但容易損壞，還會因反複經受高溫而大大縮短其使用壽命。因此，一般常采用化學試劑浸泡等方法來滅菌。但常會因滅菌不徹底，放人發酵罐後導致染

 

設備滲漏主要是指發酵罐、補糖罐、冷卻盤管、管道閥門等，由於化學腐蝕(發酵代謝所產生的有機酸等發生腐蝕作用)、電化學腐蝕(如氧溶解於水，使金屬不斷失去電子，加快腐蝕作用)、磨蝕(如金屬與原料中的泥沙之間磨損)、加工製作不良等原因形成微小漏孔後發生滲漏染菌。

 

由於操作、設備結構、安裝及其他人為因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能有效到達預定的滅菌部位，而不能達到徹底滅菌的目的。生產上常把這些不能徹底滅菌的部位稱為“死角”。

 

盤管是發酵過程中用於通冷卻水或蒸汽進行冷卻或加熱的蛇形金屬管。由於存在溫差(內冷卻水溫、外滅菌溫度)，溫度急劇變化，或發酵液的pH值低、化學腐蝕嚴重等原因，使金屬盤管受損，因而盤管是最易發生滲漏的部件之一，滲漏後帶菌的冷卻水進入罐內引起染菌。生產上可采取仔細清洗，檢查滲漏，及時發現及時處理，杜絕汙染。

 

空氣分布管一般安裝於靠近攪拌槳葉的部位，受攪拌與通氣的影響很大，易磨蝕穿孔造成“死角”，產生染菌。尤其是采用環形空氣分布管時，由於管中的空氣流速不一致，靠近空氣進口處流速最大，離進口處距離越遠流速越小，因此，遠離進口處的管道常被來自空氣過濾器中的活性炭或培養基中的某些物質所堵塞，最易產生“死角”而染菌。通常采取頻繁更換空氣分布管或認真洗滌等措施。

 

發酵罐體易發生局部化學腐蝕或磨蝕，產生穿孔滲漏。罐內的部件如擋板、扶梯、攪拌軸拉杆、聯軸器、冷卻管等及其支撐件、溫度計套管焊接處等的周圍容易積集汙垢，形成“死角”而染菌。采取罐內壁塗刷防腐塗料、加強清洗並定期鏟除汙垢等是有效消除染菌的措施。發酵罐的製作不良，如不鏽鋼襯裏焊接質量不好，使不鏽鋼與碳鋼之間不能緊貼，導致不鏽鋼與碳鋼之間有空氣存在，在滅菌加溫時，由於不鏽鋼、碳鋼和空氣這三者的膨脹係數不同，不鏽鋼會鼓起，嚴重者還會破裂，發酵液通過裂縫進人夾層從而造成“死角”染菌。采用不鏽鋼或複合鋼可有效克服此弊端。同時發酵罐封頭上的人孔、排氣管接口、照明燈口、視鏡口、進料管口、壓力表接口等也是造成“死角”的潛在因素，一般通過安裝邊閥，使滅菌徹底，並注意清洗是可以避免染菌的。除此之外，發酵罐底常有培養基中的固形物堆積，形成硬塊，這些硬塊包藏有髒物，且有一定的絕熱性，使藏在裏麵的髒物、雜菌不能在滅菌時候被殺死而染菌，通過加強罐體清洗、適當降低攪拌槳位置都可減少罐底積垢，減少染菌。發酵罐的修補焊接位置不當也會留下“死角”而染菌。

 

管路的安裝或管路的配置不合理易形成“死角”染菌。發酵過程中與發酵罐連接的管路很多，如空氣、蒸汽、水、物料、排氣、排汙管等，一般來講，管路的連接方式要有特殊的防止微生物汙染的要求，對於接種、取樣、補料和加油等管路一般要求配置單獨的滅菌係統，能在發酵罐滅菌後或發酵過程中進行單獨的滅菌。發酵工廠的管路配置的原則是使罐體和有關管路都可用蒸汽進行滅菌，即保證蒸汽能夠達到所有需要滅菌的部位。在實際生產過程中，為了減少管材，經常將一些管路匯集到一條總的管路上，如將若幹隻發酵罐的排氣管匯集在一條總的排氣管上，在使用中會產生相互串通、相互幹擾，一隻罐染菌往往會影響其他罐，造成其他發酵罐的連鎖染菌，不利於染菌的防治。采用單獨的排氣、排水和排汙管可有效防止染菌的發生。生產上發酵過程的管路大多數是以法蘭連接，但常會發生諸如墊圈大小不配套、法蘭不平整、安裝未對中、法蘭與管子的焊接不好、受熱不均勻使法蘭翹曲以及密封麵不平等現象，從而形成“死角”而染菌。因此，法蘭的加工、焊接和安裝要符合滅菌的要求，務必使各銜接處管道暢通、光滑、密封性好，墊片的內徑與法蘭內徑匹配，安裝時對準中心，甚至盡可能減少或取消連接法蘭等措施，以避免和減少管道出現“死角”而染菌。

 

管件的滲漏易造成染菌。實際上管件的滲漏主要是指閥門的滲漏，目前生產上使用的閥門不能完全滿足發酵工程的工藝要求，是造成發酵染菌的主要原因之一。采用加工精度高、材料好的閥門可減少此類染菌的發生。

 

(1)種子培養期染菌的處理  一旦發現種子受到雜菌的汙染，該種子不能再接人發酵罐中進行發酵，應經滅菌後棄之，並對種子罐、管道等進行仔細檢查和徹底滅菌。同時采用備用種子，選擇生長正常無染菌的種子接人發酵罐，繼續進行發酵生產。如無備用種子，則可選擇一個適當菌齡的發酵罐內的發酵液作為種子，進行“倒種”處理，接入新鮮的培養基中進行發酵，從而保證發酵生產的正常進行。

(2)發酵前期染菌的處理  當發酵前期發生染菌後，如培養基中的碳、氮源含量還比較高時，終止發酵，將培養基加熱至規定溫度，重新進行滅菌處理後，再接人種子進行發酵；如果此時染菌已造成較大的危害，培養基中的碳、氮源的消耗量已比較多，則可放掉部分料液，補充新鮮的培養基，重新進行滅菌處理後，再接種進行發酵。也可采取降溫培養、調節pH值、調整補料量、補加培養基等措施進行處理。

(3)發酵中、後期染菌處理  發酵中、後期染菌或發酵前期輕微染菌而發現較晚時，可以加入適當的殺菌劑或抗生素以及正常的發酵液，以抑製雜菌的生長速度，也可采取降低培養溫度、降低通風量、停止攪拌、少量補糖等其他措施，進行處理。當然如果發酵過程的產物代謝已達一定水平，此時產品的含量若達一定值，隻要明確是染菌也可放罐。對於沒有提取價值的發酵液，廢棄前應加熱至120℃以上、保持30min後才能排放。

(4)染菌後對設備的處理  染菌後的發酵罐在重新使用前，必須在放罐後進行徹底清

洗，空罐加熱滅菌後至120℃以上、30min後，才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法進行處理。