（一）直接塗片顯微鏡檢查
自病人標本直接塗片作染色鏡檢是簡便而快速的方法之一。自一定部位采集標本作直接檢查需考慮細菌的形態特征與可能存在的細菌數量。腦膜炎患者的腦脊液和瘀斑刺破塗片，常可顯示在細胞內的革蘭氏陰性腎形雙球菌，有診斷價值。白喉患者咽部假膜塗片中可見典型的杆菌有時可有異染顆粒，也有參考診斷價值。結核患者痰直接或濃集後，塗片抗酸染色檢出結核杆菌有診斷價值。在少數情況下，也有利用免疫熒光或酶標記抗體染色鏡檢方法進行快速診斷，如糞例中的霍亂弧菌、痢疾杆菌等，可用這種技術檢出。
（二）培養
大多數病菌的形態與染色並無特征，因此需用培養方法來分離與鑒定細菌。雖然這一方法需要的時間較長，但比較可靠。此外，隻有通過這一方法才能獲得細菌的純培養，可用於做藥敏試驗或毒力試驗。應根據不同細菌需要的營養、生長條件（如厭氧或CO2）、菌落生長特征來初步識別細菌。如溶血性鏈球菌需在血瓊脂平板上生長，菌落小而透明，菌落周圍有完全溶血圈，可資鑒別。多數細菌欲確定為何種病原菌尚需進一步獲得純培養及接種各種特殊培養基進行生化反應試驗或確定其抗原性與致病力等。
（三）生化反應
細菌的合成與分解代謝過程中，能通過酶利用一些物質或分解一些物質。不同的細菌具有不同的酶，因此各種細菌能夠利用與分解的物質也各不相同。利用各種細菌的不同生化反應幫助鑒別細菌在某些細菌如腸道杆菌中是很重要的步驟。例如腸道杆菌均為革蘭氏陰性杆菌。菌落形態亦相似，但對於糖的發酵結果不同，因此可利用不同種糖作為培養基質進行生化反應予以區別。
（四）抗原檢測與分析
有些細菌即使用生化反應變難區別，但其細菌抗原成份（包括菌體抗原、鞭毛抗原）卻不同。利用已知的特異抗體測定有無相應的細菌抗原可以確定菌種或菌型。常用的方法為玻片凝集反應，用已知的特異免疫血清與待鑒定的細菌在玻片上做凝集反應，如出現凝集菌團則為陽性，說明該菌有相應的特異抗原。近年采用了各種檢測抗原的敏感方法，如對流免疫電泳、放射免疫、酶免疫、氣相色譜等方法，試圖直接從患者標本中檢測細菌抗原作快速診斷。如果在細菌性腦膜炎中，利用對流免疫電泳在腦脊液中可分別檢測肺炎球菌、腦膜炎球菌及流感杆菌，特異性高，敏感性亦高。氣相色譜方法係列利用細菌代謝產生的揮發性短鏈有機酸，進行氣相色譜分析可鑒別細菌，這在厭氧菌中應用很廣。檢測抗原的另一優點為在應用了抗生素治療後，細菌生長被抑製，利用培養方法不能檢出的細菌，因尚有抗原存在，在短期內仍可被檢出，從而有助於明確病因。個別情況下還可利用噬菌體對細菌抗原型別分析，用於流行病學追蹤調查。
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