影響 MS培養基凝固效果的幾個因素的研究

    在植物組織培養過程中， 一般用瓊脂作固化劑使培養膠化， 其凝固效果直接關係培養材料的生長或生存。 

    目前已有不少關於培養基高溫高壓滅菌後 pH值變化的研究；但對於影響培養基凝固效果的具體因素研究極少。筆者以 MS 培養基為對象， 探討影響其凝固效果的多方麵因素， 以利於組培材料的生長。

 

1 材料與方法

 

1.1材料與藥品 M S培養基；瓊脂條( 海洋食品有限公司製) ； 瓊脂粉( 日本進口， 上海化學試劑) ；碳源：蔗糖、果糖、食用白糖、葡萄糖；活性炭。 

 

1.2方法  將母液兌成完全 M S培養基，用稀HC1或稀NaOH調節培養基的pH值至所需水平，在每個容量為 50m l的三角瓶中統一裝入 30 m l培養基。在不進行其相關因素實驗時，培養基中都是添加了3％蔗糖和 0.8％的瓊脂粉，分裝前pH值調至 5.8 ，118 ～120℃滅菌20 min。pH計型號pHS-3 c型酸度計，采用全量程複合玻璃電極，可精確設置被測溶液的溫度，實現溫度補償，讀數準確，方便快捷。3 次重複，滅菌後培養基置於25℃室內1h後觀察，采取多次觀察分析，用平均值進行結果統計。

 

2 結果與分析

 

2.1 瓊脂濃度和培養基pH值對培養基凝固效果的影響

 

2.1.1 瓊脂的濃度對MS培養基凝固效果的影響。表 1 顯示，瓊脂作為固化劑對培養基的凝固有直接影響，濃度的高低直接關係到培養基的凝固效果，培養基的凝固效果與瓊脂用量呈正相關。一般情況下，瓊脂濃度低於0.6％，培養基就不能很好地凝固，當濃度達0.8 ％一般就能滿足實驗要求。瓊脂在培養基中僅作為固化劑，但其中含有多種雜質成分，可能對培養基成分會有一定的影響，在用量上應加以考慮。日本進口的瓊脂粉比瓊脂條的凝固效果稍好 ，主要是因為瓊脂條的雜質多，瓊脂粉的有效成分相對高一些。這與陳永勤的研究結果相反。 

 

表 1 瓊脂濃度和培養基 pH值對培養基凝固效果的影響

 

 

 

注： 大、 小寫字母分別表示進口瓊脂粉和國產瓊脂條。A或( a ) ， 凝固很差、 完全液體狀態； B或( b ) ， 凝固差、 稀糊狀； C或( c ) ， 凝固一般、 輕晃動時會滑動； D或( d ) ， 凝固較好、 不太滑動； E或( e ) ， 凝固好、  不滑動； F或( f ) ， 凝固很好、 很硬、 培養基上有一層水。下表同。

 

2.1.2  pH值對MS培養基凝固效果的影響。M S培養基的凝固與p H值呈正相關。當p H值低於 5.5 0時， 培養基一般不能很好地凝固， 隨 pH值的提高，培養基的凝固效果明顯改善。植物組織在一定pH值下才能正常生長，因此在配製時考慮培養基凝固情況的同時， 也要注意 pH值的大小。 

 

2.1.3 瓊脂的用量與培養基 pH值的互補作用。試驗表明，當瓊脂濃度過小時， 可通過提高培養基的pH值來改善凝固效果；當pH值低時也可以通過增加瓊脂的濃度來改善凝固效果 ， 這與陳永勤的研究相一致。 

 

2.2 碳源對 MS培養基凝固效果的影響   

 

在培養基中一般要加入一定量的碳源， 碳源有降低培養基滅菌後凝固效果的效應。表 2顯示， 碳源添加後，滅菌後培養基的凝固效果明顯降低，降低程度與所添加的碳源量呈正相關； 不同碳源培養基的下降程度有差異：添加 3％蔗糖、2％食用白糖、1％葡萄糖或1％果糖時就能明顯降低培養基滅菌後的凝固效果。相同條件下， 果糖與葡萄糖的影響較大， 能顯著降低培養基的凝固效果，下降程度是果糖 >葡萄糖 >食用白糖>蔗糖。 

 

添加一定量的碳源促進了培養基滅菌過程中pH值的下降。B a l l 認為在高溫滅菌時， 培養基中蔗糖會水解成果糖和葡萄糖 ，而葡萄糖進一步變成葡萄糖酸，從而導致培養基pH值的下降。碳源在滅菌過程中水解，形成酸性物質，使培養基pH值下降，從而凝固效果降低。添加果糖、葡萄糖影響明顯，由於高溫滅菌後，果糖培養基的pH值比葡萄糖的下降幅度大得多， 更易形成酸性物質。 

 

表2 碳源對MS 培養基凝固效果的影響

 

 

注： “ +” 表示凝固效果略高於標記水平； “一” 表示凝固效果略低於標記水平。表4同。 

2.3 滅菌時間及滅菌溫度對 M S 培養基凝固效果的影響

 

由表3可知，經高溫高壓滅菌後培養基的凝固效果呈下降趨勢，滅菌時間和滅菌溫度均不同程度地影響M S培養基的凝固效果。130℃以下滅菌 l2 、15、18 、20 m i n 後培養基的凝 固效果稍有降低，各個處理表現基本一致，無明顯差異；但當滅菌時間達25 m i n以上或滅菌溫度達 130℃時 ，培養基的凝固效果呈急劇下降， 使原凝固很好的培養基凝固不好或根本不能凝固。這可能是在高溫或長時間高壓下，瓊脂的有效成分結構被破壞，凝固能力減弱 ； 同時培養基一些營養物質在高溫下水解成酸性物質，造成培養基pH值下降。常規高溫高壓滅菌溫度 118 ～125℃， 滅菌時間15～20 m i n ，培養基的凝固會有所下降，主要是因為培養基在經高壓滅菌後 p H值下降了，pH下降的原因可能是高溫滅菌時E D T A鐵鹽和其他微量元素發生了相互作用。

 

2.4 添加活性炭對 M S 培養基凝固效果的影響

在植物組織培養中為了吸附植物的有害泌出物或防止組織褐變等，在培養基中通常加入一定量的活性炭。表 4顯示， 在高壓滅菌後培養基的凝固程度明顯下降，但滅菌前加入活性炭的培養基凝固程度會急劇降低，能降低一到兩個凝固級別；活性炭的含量不同， 降低的程度略有差異， 但差異不大。 

 

表3 不同高溫下滅菌不同時間對M S 培養基凝固效果的影響

 

 

 

活性炭具有很強的吸附能力 ，有削弱瓊脂凝 固能力的作用。在配製培養基時要增加瓊脂的量或提高p H值來改善培養基在滅菌後的凝 固狀況。 

 

 

表4 不同濃度活性炭對MS培養基凝固效果的影響

 

 

2.5 晃動培養基對凝固效果的影響

在培養基冷卻凝固過程中，晃動培養基也對培養基的凝 固效果有較大影響， 影響程度與晃動劇烈程度呈正相關 ，對 B ( b ) 、C ( c ) 、D( d ) 、E ( e ) 狀態的培養基影響十分顯著， 使凝固不好的培養基不能凝固，凝固好的不能很好地凝 固。但對於不能凝 固的和很硬的培養基影響不大( 表 5 ) 。這在 N6 、B5等培養基凝固反應上是一致的。在實驗中經常用到的是 D( d ) 、E ( e ) 兩種凝固狀態， 因此晃動培養基對凝固效果也有一定影響。晃動培養基主要是破壞了瓊脂的結構。

 

表5 晃動培養基對培養基凝固效果的影響

 

 

注： I.輕輕搖晃 2圈；

Ⅱ. 在I 的基礎上稍加大力度， 搖晃4圈；

III.搖 6圈；

I V.搖晃8 ～1 0圈；

V.劇烈晃動培養基。 

 

3 小結與討論

 

通過分析瓊脂的濃度、培養基的p H、滅菌時間及滅菌溫度、碳源、活性炭、晃動培養基對 MS 培養基凝 固效果的影響，表明 MS 培養基的凝固效果主要是受瓊脂濃度和培養基的p H值影響；高溫高壓滅菌後培養基凝固不好 ，主要是因為培養基的 p H值下降了， 滅菌時間 、滅菌溫度 、碳源 、活性炭等因素影響 MS培養基的凝 固， 主要是因為它們在滅菌的過程中有改變培養基p H值的效應。在其他培養基如 N 6 、 B 5 、 Wh i t e等培養基效果也同樣主要受這兩方麵因素的影響； 相同情況下， 培養基之間的凝固效果不同， 主要是 因為在高壓滅菌過程中影響因素的影響效應有所差異。在植物組織培養過程中， 培養基的 D H值是 由培養的植物材料不同而決定 ，但培養過程對培養基的凝 固效果的要求並不因p H值而變， 所以對某種特定培養對象，即要考慮培養對象所要求的 p H值， 又要通過調整某些因素保證培養基具有一定的凝固程度。