微生態活菌總論（上）

微生態活菌製品係由人體正常菌群成員或具有促進正常菌群生長和活性作用的無害外籍細菌，經培養、收集菌體、幹燥成菌粉後，加入適宜輔料混合製成。用於預防和治療因菌群失調引起的相關症狀和疾病。

微生態活菌製品必須由非致病的活菌組成，無論在生產過程、製品貯存和使用期間均應保持穩定的活菌狀態。它可由一株、多株或幾種細菌製成單價或多價聯合製劑。根據其不同的使用途徑和方法可製備成片劑、膠囊劑、顆粒劑或散劑等多種劑型。

微生態活菌製品的製備方法、工藝應能保證成品含有足夠的活菌數量，保持其穩定性，同時應防止外源因子的汙染。

生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。

生產用菌種應符合“生物製品生產檢定用菌毒種管理規定”的有關規定。

選用的生產用菌種應來自人體內正常菌群，或對人體無毒無害、具有促進正常菌群生長和活性作用的外籍細菌。細菌的分離過程和傳代背景應清晰，應具備穩定的生物學和遺傳學特性，並能保持穩定的活菌狀態，經實驗室和臨床試驗證明安全、有效。

菌種的屬、種型分類鑒定，應依據最新版伯傑氏細菌係統鑒定手冊（Bergry’s Manual of Systematic Bacteriology）和伯傑氏細菌命名手冊（Bergry’s Manual of Determinative Bacteriology）的有關規定進行，包括形態、生長代謝特性檢查。原始種子或主種子還應做遺傳特性和抗生素敏感性等檢查。

三級種子批常規檢查包括以下3項：

（1）培養特性及染色鏡檢    將菌種接種於適宜培養基，置有氧或厭氧環境中培養，觀察其生長情況，確定菌種為需氧性細菌或厭氧性細菌；以劃線法觀察在瓊脂平皿上生長的單個菌落的形狀、大小、表麵、邊緣、透明度、色澤等特征；也可觀察菌種在不同溫度、pH或不同濃度的氯化鈉溶液等條件下的生長特性等。

取菌種的新鮮培養物塗片做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的染色反應、形態、大小和排列等，有芽孢的細菌應同時觀察芽孢的形狀、大小和位置（也可增做芽孢染色）。檢查結果均應符合原始菌種的特性。

（2）生化反應    按附錄ⅪⅤ“細菌生化反應培養基”選擇相應的培養基或其他適宜的方法進行，結果應符合原始菌種的特性。

（3）毒性試驗    毒性試驗是通過動物試驗檢查菌種是否存在不安全因素，以保證人體使用安全。

用體重18～22g小鼠5隻，每隻腹腔注射0.3ml新鮮菌液（不少於1.0×10⁹CFU/0.3ml）,連續觀察3天，小鼠均應健康存活、體重增加；或每隻小鼠經口灌胃0.5ml新鮮菌液（不少於1.0×10⁹CFU/0.5ml），每天1次，連續3天，從第1天灌胃起連續觀察至第7天，小鼠均應健康存活、體重增加。

除另有規定外，原始種子或主種子批還需進行以下檢查：

（1）細菌代謝產物——脂肪酸測定    照氣相色譜法（附錄Ⅲ Ｃ）或其他適宜的方法進行，應符合該菌種的特性。

（2）遺傳特性分析    可采用細菌DNA的G+Cmol%的含量測定或其他適宜方法進行，應符合該菌種的遺傳特性。

（3）抗生素敏感性試驗   采用瓊脂擴散紙片法或其他適宜方法進行菌株的抗生素敏感性檢查，應符合該菌種的特性。

（4）穩定性試驗    菌種在適宜培養基中，連續傳代30代次後，將第30代培養物作種子批檢定，全部檢查結果應與原始菌種的特性一致。

原始種子和主種子應凍幹保存於8℃以下，工作種子應置於適宜溫度保存。

應包括種子液製備、大罐培養、收獲菌體（或芽孢）和菌體幹燥製成菌粉。如生產多價製品時，應每種菌分別培養，製備單價菌粉。

啟開工作種子批菌種，接種於適宜培養基進行多級種子擴增，應塗片做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察5～10個視野，細菌的染色反應、形態應一致並符合原始菌種的特征。製備過程應防止汙染，菌種傳代次數應符合規定。

采用經批準的培養基用於生產。

采用液體培養。將種子液置適宜條件下培養（包括厭氧或需氧、溫度、時間等），培養過程中取樣塗片做革蘭氏染色鏡檢、pH值檢測等，芽孢菌需進行芽孢形成率的檢測，均應符合規定。培養結束後取樣做純菌檢查，如發現汙染應予廢棄。

生產多價製品的單價菌粉時，應分別培養。

培養結束後離心收獲濕菌體，與適宜的分散劑、穩定劑混合。采用真空冷凍幹燥法幹燥菌體，芽孢菌可采用加熱幹燥方法，再經粉碎、過篩製成粉末狀菌粉。

應通過活菌穩定性試驗確定保存溫度和有效期。

按“菌粉檢定”項進行，符合規定後方可進行半成品配製。

同一工作種子批菌種生產的最多2批單價菌粉可按批準的比例與輔料混合均勻後製成半成品。配製多價製品時，應將各單價菌粉、輔料按配方比例和配製程序混合均勻，配製過程應防止汙染。

按“半成品檢定”項進行，應符合規定。

根據製品的用途、使用對象和用藥途徑等因素確定劑型。製備過程應符合附錄Ⅰ“製劑通則”項下相關劑型的規定。

成品批號應在半成品配製後確定，配製日期即為生產日期。同一批號的製品，應來源一致、質量均一，按規定要求抽樣檢驗後，能對整批製品作出評定。應根據驗證結果，規定半成品的分裝時間，如超過24小時，應分為不同的亞批。

製品的分裝應符合附錄Ⅰ“製劑通則”的有關規定。包裝應符合“生物製品包裝規程”的有關規定。規格應符合批準的規格要求。

微生態活菌製品質量檢定應包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢定。

應為白色、灰白色或灰黃色粉末。

取少量菌粉加入適量，滅菌生理氯化鈉溶液或其他適宜稀釋液後，塗布在適宜瓊脂平皿上，在適宜條件下培養，其培養物的生長特性和染色鏡檢的特征應符合生產用菌種特征。

方法和結果判斷見本總論附錄3。如不符合規定應廢棄。

菌粉中殘餘水分的含量會直接影響活菌的生存，須進行菌粉幹燥失重的檢查。應按附錄Ⅶ Ｌ或儀器方法測定。

測定每克菌粉中含有的活菌數量。方法見本總論附錄2。

半成品須做雜菌檢查，根據用藥途徑確定雜菌檢查的質控指標。方法和結果判斷見本總論附錄3。

檢查成品中所含的目的菌是否符合生產用菌種的特性。即按上述“種子批的檢定”方法進行生長特性、染色鏡檢和生化反應檢查，應符合規定。對於多價製品，則須逐一檢查單價菌特性。

（1）       外觀  根據劑型，觀察製品的外觀、色澤。

片劑外觀應完整、光潔，呈白色或類白色，間有菌粉色斑；顆粒劑、散劑和膠囊劑內粉末的粒子大小、色澤應均勻，間有菌粉色斑。

（2）幹燥失重  按附錄Ⅶ Ｌ或儀器方法測定，減失重量應不得超過5.0%，芽孢菌製品應不得超過7.0%。

（3）粒度  散劑和顆粒劑應進行粒度檢查。

     按附錄ⅤＧ第二法，采用單篩分法或雙篩分法檢查，應符合規定。

（4）裝量（重量）差異  各劑型按附錄Ⅰ“製劑通則”的相應規定進行，應符合規定。

（5）崩解時限  膠囊劑、片劑按附錄ⅤＣ進行，應符合規定。

按本總論附錄2方法測定每克製品中的活菌數，應符合規定。多價製品應分別測定各單價活菌數。

目的是檢查成品中外源微生物的汙染情況，以保證人體使用安全。

方法和結果判斷與半成品的“雜菌檢查”項相同。

安全試驗是通過動物試驗進行的非特異性毒性檢查，應根據製品的使用途徑和人用劑量確定試驗方法。

（1）腸道微生態活菌製品檢查  稱取2g製品，加入8ml生理氯化鈉溶液中，混合均勻。用5隻體重18～22g小鼠，每隻小鼠經口灌胃0.5ml，每天1次，連續3天。自第1天灌胃起，連續觀察7天，小鼠應健康存活、體重增加，判為合格。如不合格，可另選10隻小鼠複試1次，判定標準同前。

（2）陰道微生態活菌製品檢查  用24～26g雌性小鼠5隻，，每隻小鼠陰道內置入10mg製品，每天1次，連續3天。自給藥第一天起，連續觀察7天，小鼠應健康存活、體重增加，陰道局部無紅腫、分泌物等症狀，判為合格。

按批準的溫度保存和運輸。自生產之日起，按批準的有效期執行。