突變與育種

一、自發突變與育種

1 ．從生產中選育 在日常的大生產過程中，微生物也會以一定頻率發生自發突變。富於實際經驗和善於細致觀察的人們就可以及時抓住這類良機來選育優良的生產菌種。例如，從汙染噬菌體的發酵液中有可能分離到抗噬菌體的自發突變株。

2 ．定向培育優良品種 是指在某一特定條件下，長期培養某一微生物菌群，通過不斷轉接傳代以積累其自發突變，並最終獲得優良菌株的過程。由於自發突變的頻率較低，變異程度較輕微，故用此法育種十分緩慢。例如，當今世界上應用最廣的預防結核病製劑——卡介苗 (BCG vaccine) 的獲得，便是定向育種的結果。這是法國科學家 Calmette 和 C ． Guerin 經曆了 l3 年時間，把牛型結核分支杆菌接在牛膽汁、甘油、馬鈴薯培養基上，連續轉接了 230 代，才在 1923 年成功地獲得了這種減毒的活菌苗 -- 卡介苗。

二、誘變育種

    誘變育種是通過人工方法處理微生物，使之發生突變，並運用合理的篩選程序和方法，把適合人類需要的優良菌株選育出來的過程。人工誘變與自發突變相比可大大提高微生物的突變率，使人們可以簡便、快速地篩選出各種類型的突變株，作生產和研究之用。

（一）誘變育種的基本環節

    誘變育種的具體操作環節很多，且常因工作目的、育種對象和操作者的安排而有所差異，但其中最基本的環節卻是相同的。

( 二 ) 一般性原則

1 ．挑選優良的出發菌株

    出發菌株是指用於育種的起始菌株。有利性狀：高產、生長速度快、營養要求粗放、產孢子早而多的菌株等。

2 ．選擇簡便有效的誘變劑

    在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果下，應選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而化學誘變劑中，以 NTG 最為有效。

3 ．處理單孢子（細胞）菌懸液

    在誘變育種中，所處理的細胞必須是單孢子或單細胞懸液狀態。其目的是：一方麵分散狀態的細胞可以均勻接觸誘變劑；另一方麵又可避免長出不純菌落。在某些微生物中，即使用這種單細胞懸液來處理，還是很容易出現不純菌落，這是由於在許多微生物的細胞內同時含有幾個核的原故。

4 ．選用最適劑量

    各種誘變劑有不同的劑量表示方式。劑量一般指強度與作用時間的乘積。化學誘變劑常以一定溫度下誘變劑的濃度和處理時間來表示。

    由於誘變劑是用來提高突變率、擴大產量變異的幅度和使產量變異向正突變的方向移動，因此，凡在提高誘變率的基礎上，既能擴大變異幅度，又能促使變異移向正變範圍的劑量，就是合適的劑量。

5 ．充分利用複合處理的協同效應

6 ．設計或采用高效篩選方案或方法

①篩選方案：在實際工作中，一般認為應采用把篩選過程分為初篩與複篩兩個階段的篩選方案為好。前者以量（選留菌株的數量）為主，後者以質（測定數據的精確度）為主。

②篩選方法：初篩可在平板上進行，也可在搖瓶中進行，兩者各有利弊，複篩必須在搖瓶中進行，並作精確測定。

( 三 ) 營養缺陷型的篩選

1 ．營養缺陷型

    營養缺陷型 (auxotroph) 某一野生型菌株由於發生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子的能力，因而無法在基本培養基上正常生長繁殖的變異類型。

    野生型（ wild type ）：從自然界分離到的任何微生物在其發生營養缺陷型突變前的原始菌株。

    原養型 (prototroph) ：一般指營養缺陷型突變株經回變或重組後產生的菌株，其營養要求在表型上與野生型相同。

    基本培養基 (MM) 能夠滿足野生型菌株生長最低限度需要的培養基。

    補充培養基 (SM) 凡能滿足相應的營養缺陷型生長需要的培養基。。在 MM 中加蛋白腖（多種氨基酸 ) 便可以用來培養各種氨基酸的缺陷型；加入酵母浸膏 ( 其中含有多種 B 族維生素和核苷酸 ) 便可以培養不同的維生素、嘌呤和嘧啶缺陷型。

    完全培養基 (CM) 凡能滿足一切營養缺陷型生長需要的培養基。

2 ．篩選過程

    篩選營養缺陷型突變株一般經過誘變處理、淘汰野生型、檢出營養缺陷型、營養缺陷型鑒定等步驟，最終篩選出營養缺陷型。

    淘汰野生型 即濃縮缺陷型。中間培養後的細胞中除營養缺陷型菌株外，仍含有大量野生型菌株，為便於篩選，須將野生型細胞大量淘汰以濃縮營養缺陷型細胞，常用抗生素法和過濾法。前者的基本原理是野生型細胞能在基本培養基上生長繁殖，可選用某種抗生素將生長狀態的細胞殺死，而留下不能生長的缺陷型細胞。

    過濾法是使能在基本培養基上生長形成菌絲體的野生型留在濾膜上，不能生長的營養缺陷型孢子則能透過濾膜。

    由此可見，缺陷型能否被濃縮，關鍵是細胞在 MM 中能否生長。為了準確地表現性狀，必須使細胞在濃縮前耗盡體內或體表的營養，故需用 MM 洗滌，然後再用 MM 加抗生素培養。

    營養缺陷型的檢出 濃縮後得到的營養缺陷型比例雖加大，但不是每株都是營養缺陷型，還需進一步分離，常用的方法有：、

①逐個檢出法 把濃縮的菌液 ( 細胞或孢子 ) 在完全培養基上進行分離培養，然後將平板上出現的菌落逐個地點種到基本培養基和完全培養基上，經過一定時間培養後，凡是在基本培養基上不能生長，而在完全培養基上能生長的菌落，經重新複證後仍然如此，則這樣的菌落便是營養缺陷型。

②夾層檢出法 在培養皿底層倒入一層基本培養基，待凝後，在其上倒入一層稀釋菌液與基本培養基的混合物，凝後再倒人一層基本培養基，培養後長出的菌落為野生型，其上再加上一層完全培養基，經過培養後新出現的菌落則多數是營養缺陷型。這種方法一般適用於細菌。

③限量補充培養基檢出法 將經過濃縮的菌液接種在含有微量 (0.6 ％或更少 ) 蛋白陳的 MM 培養基上培養，野生型迅速生長成較大的菌落，而營養缺陷型生長較慢，故長成小菌落而得以檢出。

④影印法 將已滅菌的絲絨布，包在直徑小於培養皿的小圓柱體上，這樣便製成了一個印章，它可使菌落位置不變地從一個培養皿移至另一個培養皿。具體操作方法是：把印章放在已長出菌落的平皿 ( 完全培養基 ) 上輕輕壓一下 ( 注意不要沾上培養基 ) ，然後輕輕地分別印在基本培養基和完全培養基上，培養後，在完全培養基上生長，而在基本培養基上不生長的菌落便是營養缺陷型。因黴菌孢子容易飛散，故常引起誤差。影印法是在細菌抗藥性變異研究中發展起來的技術，目前已在放線菌、酵母菌等形成小菌落的微生物育種中廣泛應用。

    營養缺陷型鑒定 營養缺陷型的種類很多，選出後需要鑒定。常用生長譜法，即是在基本培養基中加入某種物質時，能生長的菌便是某種物質的缺陷型。其步驟是，首先鑒定需要那一類生長因子，可用天然產物的混合物檢測，其次鑒定具體因子。

    缺陷營養類別的確定 常用於確定營養缺陷型類別的天然混合物有：不含維生素的酪素水解物、氨基酸混合物或蛋白陳；水溶性維生素混合物； O.1 ％堿水解酵母核酸液等。檢測方法可用濾紙法。取 0.5cm 直徑的濾紙片沾取以上溶液，放在已接菌的平皿上培養，隻要在此濾片周圍能長出菌，即可說明此營養缺陷型的類別。

    缺陷營養因子的確定 缺陷盼營養因子可能是一種，有時會是二、三種或更多。檢測可用上述濾紙法，亦可用營養組分分組法，例如，在分析 l 5 種可能的營養因子時，可按表的組合配成 5 種溶液。將組合營養因子的紙片放置於 MM 培養基上，觀察生長情況，便可根據表的營養因子缺陷示意表查出其營養缺陷因子，通過單一因子複證以確定。

營養因子的組合及其缺陷示意表