基因重組——原核微生物的基因重組

 凡把兩個不同性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，經過遺傳分子間的重新重組合，形成新遺傳型個體的方式，稱為基因重組。重組可使生物體在未發生突變的情況下，也能產生新遺傳型的個體。

    基因重組是雜交育種的理論基礎。由於雜交育種選用已知性狀的供體菌和受體菌作為親本。因此比誘變育種前進了一大步。同時也可消除某一菌株長期誘變導致產量上升緩慢現象。因此它是一種重要的育種手段。

 

原核微生物的基因重組

（一）轉化 (transformation)

    轉化是細菌中最早被發現的遺傳物質轉移形式。 l928 年 Griffith 用肺炎鏈球菌對小鼠的感染實驗以及 10 多年後 Avery 等體外轉化過程的實現，轉化因子 DNA 的證實，是現代生命科學發展的重要起點。

1 ．幾個概念

    轉化 受體菌直接吸收了來自供體菌的 DNA 片段，通過交換把它整合到自己的基因組中，從而獲得了新的遺傳特性的現象。

    轉化子（ transformant ） 受體細胞經複製分裂後出現了供體性狀的子代。

    感受態 (competence) 細菌能夠從周圍環境中吸收 DNA 分子進行轉化的生理狀態。

2 ．轉化的條件

    包括受體菌與外源 DNA 的條件。

    受體菌 隻有處於感受態的細菌才能吸收外源 DNA 實現轉化。細菌的感受態是一種生理狀態，它可以通過感受態因子（細菌生長到一定階段分泌一種小分子的蛋白質）在細胞間的轉移而獲得。這種感受態因子與細胞表麵受體相互作用，誘導一些感受態 -- 特異蛋白表達，其中一種是自溶素，它的表達使細胞表麵的 DNA 結合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有與 DNA 結合的活性。

    現在可用人工的方法提高受體菌感受態的水平，通過以 CaCl₂ 、 cAMP 等處理，後者可使感受態水平提高 10000 倍。

    外源 DNA 必須具備兩個基本條件，即具有高相對分子質量和同源性：①轉化 DNA 的相對分子質量通常在 1 × 10 ⁷ 以下，約占細菌染色體組的 0.3 ％，否則活性喪失；多數研究中，基因轉移使用的是雙鏈線性 DNA ，某些單鏈、共價閉合環狀 DNA 也可用於轉化；②親緣關係越近， DNA 的純度越高，則轉化率越高。

3 ．轉化過程

    主要通過 3 個步驟完成。

    感受態細胞的建立 可用人工方法提高受體菌的感受態水平，通常以 CaCl ₂ 、 cAMP 等處理菌體，後者可使感受態水平提日 l0 000 倍。

    DNA 的結合和攝取 首先是供體雙鏈 DNA 與受體細胞壁上的接受位點相結合。此反應的最初是可逆的，但隨著與細胞膜蛋白的進一步作用，其與細胞壁的結合則變得十分穩定而不可逆。隨後其中一條鏈被細胞表麵上的核酸酶降解，降解產生的能量協助把另一條鏈推進受體細胞。亦發現有完整的雙鏈被攝取的情況，如革蘭氏陰性菌——嗜血杆菌。

    轉化因子與染色體重組 當單鏈進入受體細胞後，便與雙鏈結構的受體染色體 DNA 同源片段發生交換重組。即與受體菌 DNA 整合，形成供體 DNA-- 受體 DNA 複合物，再通過 DNA 複製和細胞分裂而表現出轉化性狀，形成轉化子。

    能夠發生轉化的微生物有：肺炎鏈球菌、嗜血杆菌屬、芽孢杆菌屬、假單胞杆菌屬、奈瑟氏球菌屬、葡萄球菌屬和根瘤菌屬等 20 多種菌。轉化性狀也多樣：如形態變化、莢膜物質、糖發酵、耐藥性、抗原性、致病力、代謝產物、營養需要等的變化。一般轉化率為 0.1 ％一 1 ％。

    如果把噬菌體或其他病毒的 DNA （或 RNA ）抽提出，用它去感染感受態的宿主細胞，並進而產生正常的噬菌體或病毒後代，這種特殊的轉化稱為轉染。

( 三 ) 轉導 (transduction)

    1952 年 Zinder 和 Lederberg 在驗證鼠傷寒沙門氏菌是否也存在接合現象時發現了轉導現象。

    通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的 DNA 片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，從而使後者獲得前者部分遺傳性狀的現象，稱為轉導。獲得新性狀的受體細胞，稱為轉導子 (transductant) 。攜帶供體部分遺傳物質 (DNA 片段 ) 的噬菌體稱為轉導噬菌體。在噬菌體內僅含有供體菌 DNA 的稱為完全缺陷噬茵體；在噬菌體內同時含有供體 DNA 和噬菌體 DNA 的稱為部分缺陷噬菌體 ( 部分噬菌體 DNA 被供體 DNA 所替換 ) 。根據噬菌體和轉導 DNA 產生途徑的不同，可將轉導分為普遍性轉導和局限性轉導。

1 ．普遍性轉導 (general transduction)

    通過完全缺陷噬菌體對供體菌任何 DNA 小片斷的“誤包”，而實現其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉導現象，稱為普遍性轉導。

    普遍性轉導的機製——“包裹選擇模型”，當噬菌體侵染敏感細菌並在細菌內大量複製增殖時，亦把寄主 DNA 降解為許多小的片段，在裝配時，少數噬菌體 (10 -6 一 10 -8 ) 錯誤地包裝了宿主的 DNA 片段並能形成“噬菌體”，這種噬菌體稱普遍性轉導噬菌體 ( 為完全缺陷噬菌體 ) 。隨著細菌的裂解，轉導噬菌體也被大量釋放。當這些轉導噬菌體再次侵染受體菌時，其中的供體 DNA 片段被注入受體菌。

    如果該 DNA 片段能與受體菌 DNA 同源區段配對，通過遺傳物質的雙交換而進行基因重組並形成穩定的轉導子，稱完全普遍性轉導。如鼠傷寒沙門氏菌的 P22 噬菌體、大腸杆菌的 P1 噬菌體和枯草芽孢杆菌的 PBS1 和 SP10 等噬菌體中都能進行完全轉導。

    如果該 DNA 片斷不能與受體菌 DNA 進行交換、整合和複製，隻以遊離和穩定的狀態存在，而僅進行轉錄、轉譯和性狀表達，稱流產轉異。發生流產轉導的細胞在其進行分裂後，隻能將這段外源 DNA 分配給一個子細胞，而另一子細胞僅獲得供體基因轉錄、轉譯而形成的少量產物 -- 酶，因此在表型上仍可出現輕微的供體菌特征，每經分裂一次，就受到一次“稀釋”。所以能在選擇培養基上形成微小菌落就成了流成轉導子的特點。

2 ．局限性轉導 (specialized transduction)

    通過部分缺陷噬的溫和噬菌體把供體菌的少數特定基因攜帶到受體菌中，並獲得表達的轉導現象）。轉導後獲得了供體部分遺傳特性的重組受體細胞稱為局限轉導子。

(1) 局限性轉導的機製——“雜種形成模型” λ噬菌體的線狀雙鏈 DNA 分子的兩端為 12 個核苷酸單鏈（粘性未端 cos 位點），在溶源狀態下，以前噬菌體狀態存在於細胞染色體上。被誘導後，在裂解細菌時，其以粘性末端形成的環狀分子通過滾環複製形成一個含多個基因組的 DNA 多聯體，以 2 個 cos 位點之間的距離決定其包裝片段的大小而進行切割、包裝，最終形成轉導噬菌體。在極少數情況下 ( 約 10 -5 ) ，在前噬菌體兩端鄰近位點上與細菌染色體發生錯誤的切割，使其重新形成的環狀 DNA 中，同時失去前噬菌體的一部分 DNA 和增加了一段相應長度的細菌宿主染色體 DNA ，這樣形成的雜合 DNA 可正常被包裝、複製。形成的新轉導噬菌體稱為部分缺陷噬體。因為λ前噬菌體位點兩端是細菌染色體的 gal + ( 發酵半乳糖基因 ) 和 bio + ( 利用生物素基因 ) ，故形成的轉導噬菌體通常帶有 gal + 或 bi0 + 基因，故這些部分缺陷噬菌體表示為λ dga1( 缺陷型半乳糖轉導噬菌體 ) 或λ dbio( 缺陷性生物素轉導噬菌體 ) 。這些轉導噬菌體可重新侵入受體菌，侵入後，噬菌體 DNA 與受體菌的 DNA 同源區段配對，通過雙交換而整合到受體菌的染色體組上，使受體菌獲得了供體的這部分遺傳特性。

（ 2 ）局限性轉導中的低頻轉導與高頻轉導 低頻轉導 (LFT) ：由於宿主染色體上進行不正常切離的頻率極低，因而在裂解物中所含的部分缺陷噬菌體的比例是極低（ 10 -4 --10 -6 ）的，這種裂解物稱為 LFT 裂解物。 LFT 裂解物在低 m.o.i(multiplicity of infection) 情況下感染宿主，就可獲得極少量的轉導子。高頻轉導 (HFT) ：形成轉導子的頻率很高，理論上可達 50 ％，故稱之為高頻轉導。其原因是因為供體菌為雙重溶源菌，它同時有兩種噬菌體整合在細菌的染色體上。例如，大腸杆菌 K12 株，其雙重溶源菌為 E.coli K12( λ / λ dg), 即其前噬體體有λ和λ dg 為缺陷噬菌體，帶有供體 gal + 基因，但丟失了部分噬菌體本身的 DNA ；而λ噬菌體為正常噬菌體，不帶 gal 基因，但起輔助作用，稱為輔助噬菌體，可彌補λ dg 的不足，使λ dg 也能成為“完整噬菌體”而釋放。這樣，一個細菌便可同時等量地釋放出λ dg 和λ兩種噬菌體，這時的裂解物稱為 HFT 裂解物，當用低   m.o.i 的 HFT 裂解物去感染另一個 E.coligal - 受體菌，是可高頻率的把它轉化為能發酵乳糖的 E.coligal + 轉導子。這種方式稱為高頻轉導。

    當溫和噬菌體感染其宿主而使之發生溶源化時，因噬菌體的基因整合到宿主的基因組，而使後者獲得了除免疫以外的新性的現象，稱為溶源轉變。

( 三 ) 接合 (conjugation)

    指供體菌和受體菌完整細胞間的直接接觸，而實現大段的 DNA 傳遞現象。

    Iederberg 和 Tatum 於 1946 年設計了一個有名的實驗，才證明了原核生物的接合現象。他們篩選出了兩種不同營養缺陷型的大腸杆菌 K12 突變株，其中 A 菌株是 met- 、 bio- ， B 菌株是 thr- 、 Leu- ，將它們在完全培養基上混合培養後，再塗布於基本培養基上。結果發現，在基本培養基上出現了 met + 、 bi0 + 、 thr + 、 1eu + 的原養型菌落 ( 約為 10 -7 ) ，而分別塗布的兩種親本菌株對照組都不出現任何菌落。進一步的實驗證實，上述遺傳重組的形成，是兩個親本細胞接合以後發生基因重組的結果。在細菌中，接合現象發研究最清楚的是 E.coli ，研究發現 E.coli 是有性別分化的，決定性別的是一種質粒，即 F 因子。現在根據 E.coli 細胞中是否存在 F 因子以及在細胞中的存在方式不同，可把大腸杆菌分成以下四種類型。

    F + 菌株 F 因子以遊離狀態存在，可獨立於染色體進行自主複製。一般有 1-4 個，且細胞表麵有相當數量的性菌毛。

    F - 菌株 不含 F 因子，無相當數量的性菌毛。

    Hfr 菌株 F 因子整合在宿主染色體的一定部位，並與宿主染色體同步複製。發現 Hfr 與 F - 菌重組的頻率要比 F + 菌與 F - 菌重組的頻率高得多。

    F ′菌株 因為 F 因子整合到染色體上是一種可逆過程，當 F 因子從 Hfr 菌染色體上脫落時，會出現一定概率的錯誤基因交換，從而使 F 因子帶上宿主染色體的遺傳因子，這時的 F 因子稱為 F ′因子。

    幾種接合的結果

    F+ × F- 接合 通過 F + 菌產生的性菌毛把兩者連接在一起，並在細胞間形成胞質橋 ( 或稱接管 ) ， F 因子通過胞質橋進入受體細胞，使重組體從 F - 變成了 F + 菌。其主要過程是， F 因子的一條 DNA 單鏈斷裂 ( 在特定位點上 ) 、解鏈，並單向轉移進入受體細胞，在此作為模板而形成新的 F 因子；另一條在供體細胞內的 DNA 鏈也成為模板並以滾環模型形式複製；最終供體菌及受體菌均成為 F + 菌。

    Hfr × F- 接合 當 Hfr 與 F- 菌株發生接合時， Hfr 的染色體雙鏈中的一條單鏈在 F 因子處發生斷裂，由環狀變為線狀， F 因子則位於線狀單鏈 DNA 之末端。整段線狀染色體也以 5- 末端引導，等速轉移至 F - 細胞。在沒有外界因素幹擾的情況下，這一轉移過程的全部完成約需 100 分鍾。實際上由在轉移過程中，使接合中斷的因子很多，因此這麽長的線狀單鏈 DNA 常常在轉移過程中發生斷裂。所以處在 Ffr 染色體前端的基因，進入 F- 的幾率就越高，這類性狀出現在接合子中的就越早。由於 F 因子位於線狀 DNA 的末端，進入 F- 細胞的機會最少，故引起 F- 變成 F+ 的可能性也最小。因此 Hfr 與 F- 接合的結果其重組頻率雖最高，但轉性頻率卻最低。

    F ′與 F- 接合 通過 F ′與 F- 的接合就可以使後者變成 F ′。它既可使後者前者的 F 因子，同時雙獲得前者的部分遺傳性狀。

（四）原生質體融合（ protoplast fusion ）

    通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質體發生融合，並進而發生遺傳重組以產生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩定的融合子（ fusant ）的過程 .

    能進行原生質體融合的細胞是極其廣泛的，不僅包括原核生物，而且還包括各種真核細胞。原生質體融合的優越性在於：

1 ．它打破了微生物的種屬界限，可以實現遠緣菌株的基因重組。 1981 年 Yamada 有 PEG 誘導酵母原生質體與細菌細胞成功的融合，並使其固氮作用或光合作用實現了不穩定的表達。

2 ．原生質融合可使遺傳物質傳遞更為完整、獲得更多基因重組體的機會，有利於提高育種速度。

    此外原生質體融合技術還可用於研究細胞質遺傳、核質關係等問題，因此原生質體融合技術在生產實踐及理論研究上均有具有重要意義。

    原生質體融合技術及育種步驟

1 ．原生質體的製備

    製備原生質體是保證實現原生質融合技術的關鍵。主要是要去除細胞壁。

2 ．原生質體再生

    是指去壁後的原生質體能重建細胞壁，恢複細胞完整形態，並能生長、分裂的過程。這是原生質融合育種的必要條件。通常在原生質體融合前要測定原生質體的再生率，以此分析其融合率不高是由於雙親株原生質體本來就沒有活性或再生率低，還是由於融合條件不適所致。因此測定原生質體形成率和再生率不僅可作為檢查、改善原生質體形成和再生條件的指標，也是分析融合實驗結果，改善融合條件的一個重要指標。

3 ．原生質體融合

    原生質體融合方法 主要有生物助融（通過病毒聚合劑如仙台病毒等病毒和某些生物提取物等使原生質體融合）、物理助融（離心沉澱、電脈衝等）、化學助融（通過化學助融劑如 PEG 加 Ca 2+ ）。

4 ．融合子的檢出與鑒定

    原生質體融合育種的主要目的在於迅速準確地檢出各種類型的融合子，並通過鑒定、篩選等步驟，及時選出穩定高產的融合子。

①融合子的檢出

    直接檢出法 將融合液塗布於無雙親株生長所必要的營養物或存在抑製雙親生長的抑製物的再生平皿上。

    間接法 用影印法

②融合子的鑒定

    經過傳代選出穩定融合子，可從形態學、生理生化、遺傳學及生物學等幾方麵進行鑒定。如菌落形態和顏色變化，代謝產物的產量， DNA 含量分析等。