不同環境溫度下的大腸杆菌數量監測及生存機製研究

    環境監測中，生物監測能準確地反映環境汙染物對生物和人體是否有害以及其影響有多大，具有物理-化學監測無法替代的優越性。由於生物監測在我國起步較晚，尚沒有形成法定的生物監測指標體係，目前的環境質量定量考核、排汙收費、許可證發放等環境管理重要環節除了細菌學個別指標外，大多數生物監測指標末能應用。然而隨著經濟的發展，城市人口的急劇增加，隨之而來的大量未經處理的生活汙水直接排放，其中攜帶的大量有害的病原菌、病毒，必定會對生態環境和人民身體健康產生較大的危害。例如1998年上海甲肝大流行，其原因就是食用受人糞便汙染的毛蚶造成的。因而加強對目前生物監測中僅有的法定指標大腸杆菌的監測，對於環境保護和確保人民身體健康都具有重大的意義。然而目前我國絕大多數的環境監測部門都采用經典的多管發酵法，在特定的環境條件下就有其一定的局限性。本文就不同環境溫度下大腸杆菌監測的各種方法進行了比較和研究。

 

1.材料與方法

 

1.1實驗菌株

    實驗菌株為埃希氏大腸杆菌Escherichia coli ，由中國藥品生物製品檢定所菌種室提供。

 

1.2實驗水體

    容積為1L的三角瓶內裝800ml 經0.2μm孔徑的微孔濾膜過濾並經121℃蒸汽滅菌20min的自來水， 用帶有2ml移液管橡皮塞密封。實驗過程中的取樣用注射器通過移液管頭上的密封的乳膠頭取樣。

    菌種經液體營養培養劑在37℃下振蕩培養24h，分別加入實驗水體中，使細菌濃度為 10⁸個 /ml。

    將該實驗裝置分別置於5℃和25℃和溫度環境中，定時取樣計數。

 

1.3計數方法

 

    平板計數法：采用常規塗布平板法，37℃24h後計數。培養基為營養瓊指和伊紅美蘭瓊脂。

    多管發酵法：采用五管法，培養劑為液體EC培養基。

    細菌總數：采用AODC法， 具體操作按徐懷恕方法進行。

    活菌直接計數：采用Kogure等方法：向水樣加入0.002%萘啶酮酸（Sigma 公司）和0.025%酵母膏，在37℃下培養6-24h，加入甲醛（最終濃度為2%）固定，再按AODC法鏡檢計數。

 

2. 結果與討論

    很長時間以來，人們都用培養法來評價細菌的數量，20世紀70年代以後隨著檢測細胞活性和放射性自顯影等新技術的應用，科學家們發現一些細菌在受到環境壓力時，細菌會失去在常規培養基上的生長能力，但細菌仍是活的。當人們監測環境的汙染程度時，這種活的非可培養狀態就有特別重要的意義。各國科學家對此進行了大量的研究，很多種細菌如弧菌屬的大部分種:沙門氏氣單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、產氣腸杆菌、糞鏈球菌、惡臭假單胞菌、 索氏誌賀氏菌、空腸彎曲杆菌等等都被證實能夠進入活的非可培養狀態，並且隨著研究的深入這類細菌的種類正在不斷地增加，可以肯定汙水中也存在大量的這類細菌，對於這些細菌的活的非可培養狀態的研究是正確全麵評價汙染物排放對生態環境影響的一個重要方麵。我們以埃希氏大腸杆菌（E.coli）為研究對象，以5℃和25℃為環境溫度，進行汙水細菌生存機製的研究。

 

2.1  5℃環境中的細菌生存

E.coli 在5℃環境中的生長情況見表1

 

表1 5℃下的大腸杆菌數量（單位：個/ml）

 

在整個試驗過程中， 細菌總數（ AODC 法） 和活菌數（DVC法）變化不大， DVC值比AODC 值低一個數量級左右，而通過多管發酵法和塗布平板法的數量，隨著時間的推移逐步減少。從實驗初期的10⁴個/ml減少到10-100個/ml。直接鏡檢法測得的細菌總數不變， 而培養法測的細菌數明顯下降， 說明細菌正逐步失去“ 可培養性” ，進入一種非可培養狀態。但是可培養細菌數量的減少比較緩慢，直到實驗結束時（ 第56天） 還維持 10-100個/ml， 沒有完全進入非可培養狀態。

 

2.2  25℃環境中的細菌數量

 

E.coli在25℃ 的生長見表2，可以看出細菌總數（AODC法）和活菌數（DVC 法）在實驗期間數量變化不大，DVC值比AODC值低一個數量級左右，與5℃情況相同。相對而言， 多管發酵法和塗布平板法的數量隨著時間的推移，以較快的速度減少，第29天可培養數為零， 說明完全進入了非可培養狀態。

 

表2   25℃下的大腸杆菌數量（單位：個/ml）

 

 

    關於E.coli的非可培養狀態，Colwell、Oliver、Linder、Byrd和中國的徐懷恕等人均有報道。 從本試驗的數據來看， 低溫5℃雖然能使可培養細菌數減少， 但速度很緩慢，在第56d 還維持著10-100個/ml的濃度，而在25℃下，可培養細菌數反而迅速降低，第29d時已降為零。G.Bogosian 在研究E.coli在河水中的死亡率時，發現在沒有滅菌的土壤浸液中E.coli在4℃下100d時細菌數量為100個/ml(起始濃度為10⁹個/ml） ， 在 37℃時12天就達到了這個數量。與我們的實驗結果相似，可以認為在較高的溫度下容易進入非可培養狀態，在較低的溫度下反而需要比較長的時間。 同樣的情況Rollins和Colwell在1986年作了報道， 他們的實驗菌種為C.jejuni,在37℃時該菌在10d左右的時間內完全進入了非可培養狀態，而在 4℃時在120d後卻還保持著較高的可培養菌數。1992年Medema重複了這個試驗並作了報道。另外，Hussong在1987年對L.pheumophular 的非可培養研究中， 得到了類似的結果。因此， 低溫雖然是許多細菌（ 如Vibrio vulnificus ） 進入非可培養狀態的重要條件，但是不同的細菌並不都是如此。既使同種細菌間進入非可培養狀態的時間也不盡相同。

 

3.小結

    以埃希氏大腸杆菌E.coli 為試驗對象，研究了細菌在不同溫度下的生存機製，結果發現：該細菌進入水體後，無論在低溫5℃下還是在高溫25℃下都會進入非可培養狀態，即用常規培養法難以檢測， 但細菌仍是活的。因而汙水排放後，大量的細菌可能以活的非可培養狀態存在，用常規的監測方法難以正確表達其數量。有的還會寄生在浮遊生物體內，在適宜的環境條件下又會複活。這就要求我們在日常工作中除了常規監測，應盡可能地應用新的技術如：熒光顯微鏡直接鏡檢法、熒光單克隆抗體培養等監測手段，努力作到客觀、準確、 全麵地反映汙染排放對生態環境的影響以及對人民生命健康的潛在威脅。