培養基手冊2005——1

體外培養（in vitro culture）包括：組織培養（tissue culture）、細胞培養（cell culture）、器官培養（organ culture）。顧名思義，就是將活體結構成分（如活體組織、活體細胞或者活體器官等）從體內或其寄生體內取出，放在類似於體內生存環境的體外環境中，讓其生長發育的方法。廣義組織培養與體外培養同義。

體外培養已經曆了約一百年的發展曆史，但發展初期進程比較緩慢，沒有引起很多學者的重視。直到上世紀50年代後期，體外培養技術才廣泛應用於生物學研究的各個領域，使這項技術得到飛速發展。現在體外培養已成為細胞工程、基因工程、抗體工程的重要組成部分。

細胞培養指從生物機體取出部分組織分散成單個細胞或直接從機體取出單個細胞，也可把體外培養細胞分散成單個細胞在體外條件下培養，細胞能繼續存活與增殖。培養過程中細胞不再形成組織。

發展與完善細胞培養技術圍繞防止汙染、改進培養方法、設計新型培養容器、設計不同的培養液等幾個方麵進行。

1885年Roux溫生理鹽水培育雞胚組織；

1903年Jolly，1906年Beebe等發明了蓋片懸滴培養；

1907年Harrison培養蛙胚神經成功，開始創建蓋片凹玻璃懸滴培養法；
1910、1912年Carrel采用無菌操作、更新培養基、傳代，完善了懸滴培養法；
1924年Maximow采用雙蓋片懸滴培養法；
1923年Carral設計創立了卡氏瓶培養法，用此法可根據需要隨時更換培養液，既有利於組織不斷生長，又可以運用不同種類的營養液培養不同的細胞，極大地推動了當時組織培養研究。

Earle等加以改進，使大量細胞能直接生長於玻璃瓶壁上，培養了正常細胞與腫瘤細胞的細胞株。至此大多數研究人員都采用培養瓶培養細胞。

組織培養從二十世紀40年代起迅速發展,在培養容器、培養基和培養技術等方麵出現了很多革新。

在培養容器方麵, 由簡單的用試管、旋轉管培養，發展到多種培養瓶培養，近年來，塑料瓶、皿、多孔培養板的使用已日趨普遍。

在培養基方麵，從50年代初，Parke、Eagle等設計出合成培養基後，從純天然培養基到合成培養基、從雞胚浸出液發展到動物血清（促細胞生長物），直至60年代設計出無血清培養基。

首先反映在設計不同種類的緩衝鹽溶液，以用來培養不同的細胞和洗滌細胞。Earle在1948年設計了含有碳酸氫鈉等鹽類的Earle氏鹽溶液，Hank’s在1949年設計了Hank’s氏鹽溶液。

在培養技術方法方麵，革新進展更為迅猛，Earle、Dulbecco等於1943年創建單層細胞培養法，首建長期傳代的L-細胞係。
　　1948年Sanford創建單細胞分離培養法，獲L-細胞純係。
　　1951年Gey首建人腫瘤細胞——Hela細胞係。
　　1961年Hayflick首建人二倍體細胞係25種，開辟了應用新方向。
　　從50年代末開始，組織培養技術應用進入了一個繁盛的階段，廣泛應用於生物學和醫學研究各個領域。
　　誘變建立遺傳缺陷細胞株、雜交瘤技術製備單抗、發展細胞大量培養技術、利用重組技術構建工程細胞株，已成為生物工程的重要生產手段。

在連續灌注培養工藝方麵，美國Ohashi,Ryo等人2001年報道采用2L一次性生物反應器灌注培養雜交瘤細胞生產單克隆抗體，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1％聚醚F-68為培養基，最高活細胞密度超過1×10⁷cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用帶超聲細胞分離器(UCS)的連續灌注攪拌罐生物反應器培養鼠雜交瘤細胞生產單克隆抗體，穩態培養時活細胞密度超過2×10⁷cells/ml；2004年德國Thomas等人在1L攪拌罐生物反應器中培養rCHO細胞生產人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖濃度限製的高產率灌注工藝減少有害代謝物，代謝轉向TCA循環增加，活細胞密度保持在(1～2)×10⁷cells/ml。

在流加懸浮培養工藝方麵，美國麻省理工Xie Liangzhi等人2000年報道在2L生物反應器中流加培養雜交瘤細胞，通過營養控製降低氨和乳酸的比生成速率，補充培養基包括營養成分、胎牛血清和痕量金屬，最大活細胞密度達到1.7×10⁷cells/mL。

1．科學研究

（1）藥物研究開發，如新藥篩選，疫苗、基因工程藥物、細胞工程藥物 

研究與開發、單克隆抗體製備等。

（2）基礎研究，如藥物作用機理、基因功能、疾病發生機理等研究。

2．生物製藥

（1）疫苗生產：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫

苗（腫瘤疫苗)等。

（2）基因工程藥物生產：如EPO等。
（3）抗體藥物、基因治療藥物生產。
（4）細胞工程藥物生產：生物細胞內的一些生物活性多肽，生物活性物質等。

（5）利用細胞法體外測定生物活性物質的活性；並預測其在體內的藥效和替代體內法檢測其成品的生物活性。

人工模擬細胞體內生長的營養環境，維持細胞生長的營養物質,它是提供細胞營養和促進細胞生長增殖的物質基礎。包括：

1．天然培養基

指來自動物體液或利用組織分離提取的一些培養基，如動物血漿、胚胎浸出液、血清和人血清，水解乳蛋白等。

2．合成培養基

人工設計、配製的培養基，如MEM、199、DMEM、RPMI1640等。

 

動物細胞大規模培養已成為生物製藥領域最重要的關鍵技術之一，並以其研究的深入和進展推動生物技術產業的迅速發展。專家預言：蛋白治療藥物如糖蛋白、抗體和多肽藥物僅僅隻是剛剛開始進入市場，預計在下一個10年或20年會有更為快速的發展。屆時，蛋白治療藥物的迅速增長和市場需求將遠遠超過全世界的生產能力。

動物細胞規模化生產重組蛋白和抗體的工藝選擇可考慮使用當前較成熟的工業化支持技術平台，以縮短產品工藝研發的時間，加快工業化進程。當前已獲FDA批準的生物技術產品以及公開發表的生產工藝中，占有主流優勢的是攪拌式生物反應器懸浮培養，工藝設計是流加或灌注培養。其大規模細胞培養生產所麵臨的挑戰是獲得最大生產力的同時注重維持產品的質量；去除所有培養環境中外源因子的汙染；更為精確有效的工藝控製手段；規模化培養中氧氣的限定與溶解CO₂濃度累積的控製等。 

1996年1月至2002年12月美國獲得成功批準的不同的治療劑和診斷劑產品共31種，其中用哺乳動物細胞培養生產的就有21種。動物細胞培養技術已經成為一個受到普遍信任的產業化生產技術，並逐步形成商業化操作水平。

動物細胞大規模培養技術集中在細胞係、細胞培養基和細胞生物反應容器三個方麵，構成生物製品生產的必要條件。

其中細胞是病毒、蛋白的表達載體，細胞質量直接影響蛋白的表達量或病毒的滴度，故篩選、馴化優質細胞是關鍵。而隻有好的細胞培養基才可能篩選、馴化出優質的細胞。

細胞生物反應容器也在不斷發展，以轉瓶、反應器為主要細胞生產設備，配合高密度培養、微載體培養、懸浮培養技術，均需要相適應的細胞培養基以充分發揮作用,獲得高表達、高產量，降低生產成本。

 

        細胞培養技術對生物製品成本的影響

1．表達量提高

通過細胞培養技術的不斷改進可以充分利用現有設備，大幅度提高生物製品表達量，降低生物製品的單位製造成本；同時，由於產量提高並不新增固定資產投資，也帶來生物製品的單位固定成本的降低。

因此提高表達量可以有效降低生物製品的單位成本，既降低變動成本，也降低固定成本，使得製品利潤率提高，市場競爭能力增強。

2．培養液成本降低

在很多使用牛血清的細胞培養液中，為牛血清支付的成本遠遠高於培養液中的細胞培養基等其它成分，因此通過采用低血清細胞培養基，降低牛血清用量，可以降低細胞培養液總成本。

3．純化成本低，製品安全性提高

牛血清的使用量不僅增加了細胞培養液的成本，更嚴重的是帶來動物來源成分、雜蛋白，以及不安全因素，這些成分越多，純化的成本越高、生物製品原液損失越大，生物製品的成本越大。因此采用低血清、無血清培養細胞可以有效降低純化成本何損失，提高生物製品成品率和利潤率。

4．綜合成本降低

綜上所述，動物細胞培養技術是生物製品產業化的核心技術之一，在生產中，應該係統、全麵的研究細胞培養技術對生物製品成本的綜合影響，不斷追求最佳的細胞培養技術，提高生產效率，有效降低生物製品成本，提高利潤率，增強產品市場競爭力。

1．基本營養物質

（1）    糖

六碳糖主要能源、維持滲透壓，含葡萄糖1-5%。

（2）    氨基酸

維持生存需12種氨基酸（精、胱、亮、異亮、賴、蛋、苯丙、蘇、色、組、酪、纈）。穀氨酰胺需量最大,缺乏時細胞生長不良。

單細胞培養或細胞量少時,所需氨基酸的種類和量增多，細胞主要利用左旋氨基酸異構體。

（3）    維生素

細胞大部分需水溶性B族維生素，Vitc不可少，1-10mg/100ml可促進正常細胞生長繁殖。

2．促生長因子、激素類物質

3．其它物質

基本元素、微量元素、促細胞貼附物質(纖粘連蛋白、層粘連蛋白laminin、IV型膠原、氨基多糖類)

4．水

主要成分和生存環境,要求高純度水。

5．溫度

哺乳動物及人源細胞最適培養溫度為35℃—37℃,對低溫耐受力比高溫強。39℃以上受損→死亡；不低於0℃時（0℃-34℃），細胞能生存，但代謝降低、分裂延緩。

6．氣體環境和pH

需O₂、CO₂，通氧量過大對細胞有毒害。

CO₂主要與維持pH有關，細胞培養最佳pH為7.2—7.4，通過緩衝係統和調節CO₂含量，維持正常pH。

開放培養要求5%CO₂環境、HEPES(羥乙基呱嗪乙硫磺酸)10—50mmol/ml可防止pH變化。

含Earle’s緩衝係統的培養基適合於5％CO₂的培養條件，Hanks’緩衝係統的培養基僅含有0.35g/L NaHCO₃，不能用於5％CO₂的環境，若放入CO₂培養箱，溶液將迅速變酸，使用時應注意。

7．濕度和光

開放培養相對濕度控製在95%。細胞培養需避光，紫外線或可見光可造成核黃素、酪氨酸、色氨酸等產生有毒的光產物，抑製細胞生長，降低其貼壁能力。

8．影響細胞生長的其它因素

接觸橡膠用品、收集細胞時離心速度過大、細胞接種濃度過低等。