《水生微生物實驗法》——滅菌法（1）

微生物實驗及生產中為了排除其他微生物的幹擾獲得準確結果，必須將有關物品包括實驗者的雙手都要滅菌或消毒．滅菌是應用物理的或化學的方法殺死或除去物品上的一切微生物或芽胞。消毒一般用化學藥品把物品上的微生物營養體殺死．而不一定能把所有微生物及其芽胞都殺死。消毒與滅菌的方法很多，但可分為物理和化學法兩大類。如高溫滅菌，輻射滅菌、幹燥滅菌，超聲波殺菌，過濾除菌等皆屬物理法．而用酸堿．重金屬鹽有機化合物、鹵素及其化合物等均屬於化學法．

（一）物理滅菌法

1 ．高溫滅菌法

每一種微生物都有它的最適生長繁殖的溫度範圍．當溫度超過微生物生長的最高溫度時．將引起其蛋白質凝固，致死微生物，所以一定溫度下可滅菌，特別是100 ℃ 以上的高溫，滅菌效果更好。

( l ）幹熱滅菌：用幹熱滅菌方法有以下多種．

① 焚燒滅菌法．即將接種環和針、玻璃捧、試管口、錐形杯口、載玻片等在接種前後直接在火焰上焚燒滅菌．玻璃器皿要轉動，不必燒至紅。這些器具焚燒後須在火焰旁（塞回棉塞的容器除外）得冷後才能進行下一步工作，否則會致死菌種或使瓶口破裂。實驗動物或廢物也可直接焚燒滅菌．這種方法可靠方便，但使用範圍有限。

② 幹熱滅菌法：它是用幹燥箱（烘箱）內的熱氣來滅菌口操作方法如下

a. 把洗淨包裝好的移液管．培養皿和金屬用具及某些蒸汽不能穿透的物質放在電幹燥箱（電烘箱）內。

b ．打開電源使溫度逐步升至140-170 ℃ ，一般為160 ℃ ，保持1-2 小時恒溫，可達到滅菌目的。

c.調節開關，使溫度逐步降至50-70 ℃ 方可把箱內的滅菌物品取出，否則，突然降低或是開始時突然升溫，均會引起玻璃器皿破裂。此法的滅菌時間較長，原因在於蛋白質在幹熱條件下不易凝固（表2 一2 ）。

表2 -2 蛋白質含水景與凝固溫度關係

如果滅菌物品的體積大，傳熱較差或物體堆積過擠，需適當延長滅菌時間。幹熱滅菌法的適用範圍隻是玻璃器皿和金屬用具等耐熱物品及蒸汽不能穿透的甘油和其他油類等物質。其優點是能保持滅菌物品的幹燥。

（2）濕熱滅菌法：幹熱法需較高溫度，較長時間才能達到滅菌目的。而濕熱滅菌法卻可在較低溫度、較短時間達到相同目的。從蛋白質含水量越高其凝固溫度越低的關係（表2-2 ) ，就可清楚理解此法相對幹熱法的優點是能在較低溫度下達到滅菌目的．能省燃料、省時間，因此效率高．

表2-3 蒸汽壓力與蒸汽溫度關係

① 蒸汽滅菌法：實驗室積生產上廣泛使用高壓蒸汽鍋。有臥式、立式和手攝式三種，它們具有密閉的外殼和內夾層，夾層及鍋中可充滿飽和蒸汽取代空氣，故鍋內與夾層內的溫度可隨壓力的提高而增高（表2-3) ．消毒鍋的致死微生物主要在於高溫，同時也由於蒸汽穿透力強，所以一般采用121 ℃ 蒸汽壓力下處理15-30 分鍾即可達到徹底滅菌目的，是一種迅速而高效的滅菌法。對體積大、熱傳導性較差的物品，加熱時間需延長．利用高壓蒸汽鍋滅菌主要是靠內部蒸汽溫度升高滅菌，而不是靠升高壓力，因此，若空氣沒排盡，壓力雖然達到，而溫度卻達不到要求，滅菌效果將受到影響。

若鍋內空氣沒排盡，鍋內的溫度達不到要求，就得延長滅菌時間，或升高壓力使達到所要求溫度，也需要廷長時間，這樣就不能達到高效。故滅菌時應先將鍋內的冷氣排盡。

立式或手提式高壓蒸汽消毒鍋操作步驟及注意事頂：

a.打開進水閥，從漏鬥加水到鍋內夾層．待水位達到標誌的高度時停止，關閉閥門。加到鍋內夾層的水最好是煮沸過的．以減少水垢在鍋內的積存。

b ．將已包裝好的滅菌物品裝到鍋內，不能裝得太擠．否則會影響蒸汽的流通、影響滅菌效果。

c ．對角地、平衡地擰緊鍋蓋上的螺旋，使鍋蓋關密，勿漏氣。

d ．點燃熱源（電熱器、煤氣燈等均可用）和關閉排氣孔。

e ．當壓力計至0.2 公斤／厘米²時開放排氣孔，放出鍋內殘留的冷氣．反複兩次，待鍋內的冷氣排盡，即可關閉氣孔；也可點燃熱源時就開放排氣孔，而後見排氣口有大量蒸汽排出的現象時，就可視為鍋內的冷氣已排盡．此時應將排氣閥關閉．鍋水在沸騰升溫、升壓中。

f ．當鍋內的溫度升至121 ℃ 或壓力為1 公斤/厘米²時，控製熱源，使溫度及壓力都能穩定在這個水平上15-30 分鍾。

g ．關閉熱源。如果滅菌的材料體積大，或多而擁擠，使溫度達不到標準時，應當延長滅菌時間後，才能關閉熱源。

h ．待壓力降為零時打開排氣孔。不能過早地打開排氣孔，以免鍋內壓力加速降低；但又不能同時很快地降溫，而使培養基沸騰起來，沾汙棉塞，甚至衝出容器，造成汙染。

i ．打開滅菌鍋蓋，取出滅菌物品。

j ．旋開排水閥，放盡鍋內剩水。

使用高壓蒸汽壓力鍋時必須嚴格遵守所規定的壓力，溫度和滅菌時間，不然會影響實驗結果的正確性。對含有乳糖作發酵鑒定用的培養基消毒滅菌壓力不宜超過8 磅，時間不宜超過10 分鍾。

如果使用臥式的高壓蒸汽鍋，一般用蒸汽作為熱源，不必灌水，排水，但打開蒸汽進入閥時，必須慢慢地旋開，不北蒸氣猛衝鍋內。其他的操作過程基本上同立式高壓蒸汽鍋。

高壓蒸汽鍋隻適用於各種耐熱物品的滅菌，如普通培養基、生理鹽水、淡水、海水、玻璃器皿、工作服等的滅菌。

② 煮沸消毒法：它是利用微生物營養細胞體和一部分芽胞在煮沸15 分鍾後即死亡的原理而設計的。如果延長煮沸時間並在水中加1%碳酸鈉或2-5%石炭酸，效果更好。此法適用於注射器、解剖用具等的消毒。

③ 間歇滅菌法：這是通過幾次反複蒸煮或通過幾次蒸汽處理而達到滅菌的方法。其步驟是將待滅菌的物品放在阿諾德氏（Arnold ）滅菌器或蒸鍋，或蒸籠內，常壓下，100℃ 處理15-30 分鍾，以殺死微生物營養細胞。冷後放於28-37 ℃ 下保溫24 小時，使其中殘留的芽胞萌發成營養細胞，再以同樣方法經三次處理就可將所有的營養細胞和芽胞殺死。此法較費時，一般僅用於不耐熱藥品．營養物（牛奶、維生素… … ），特殊培養基等。在缺乏高壓蒸汽滅菌鍋時亦可川於一般物品的消毒。

④ 巴斯德（Pas teur ）消毒法：它適用於牛乳、酒類、食醋、醬油等不能耐高溫（100 ℃ ）的食品的消毒，殺死其中的病原菌，如結核杆菌、傷寒杆菌等和多數細菌的營養體，而不損害食物的營養與風味。方法是以63-66 ℃ 處理30分鍾．或71℃ 處理15 分鍾。

2 ．過濾除菌法

它是利用一種過濾器，如瓷過濾器、石棉過濾器或玻璃過濾器等，將血清、毒素、酶、維生素、蛋白質、糖，抗生素等，以及其他一些熱不穩定的物質（如含碳酸氨鈉的緩衝液，受熱失去CO₂ 變成碳酸鈉）過濾除去遺留在濾板上微生物，若濾板孔徑不超過l 納米，則可得無菌液。病毒能通過過濾器，所以過濾法隻達到無細菌，不能達到無病毒。經過濾的水可除去90-99%的細菌。

過濾除菌要用細菌過濾器，其形式很多，主要有以下幾種：

( 1 ）矽藻土過濾器（又稱：Berkefeld 或Mandler濾器）固濾板部分形似蠟燭，所以又稱“濾燭” , 矽藻土濾器有許多類型．它們的區別在於濾器的孔徑和容積的大小。孔徑可分為粗、中、細，即“V ”、“N”、“ W” 三種型號。V 型的孔徑最大，小細菌可通過，W 型的孔徑小於0.1 微米，N 型處於二者之間。

這些濾器標有過濾所需的壓力。過濾時把待濾液注在玻璃外套濾燭之間，用過的濾燭經處理後，可多次使用。

( 2 ）蔡氏石棉板濾器（又稱賽氏濾器，即Seitz濾器） ：伯克費爾德（Berkefeld）濾器易損壞，且較難過濾。蔡氏濾器較易過濾，使用簡便。常用的有E , V 型，濾板孔徑的大小相當手矽藻土濾器的W 型。它是金屬筒製成的，分上下兩節，過濾時用螺旋把石棉板緊夾在上下節間，然後將待濾液傾入濾器抽濾。每次過濾必須更換一張新的石棉濾板。石棉板濾器因其容積大小不同，而有各種型號。

( 3 ）玻璃濾器（砂芯細菌漏鬥）: 它的外型是個圓筒狀的玻璃漏鬥．在漏鬥底部有一塊砂濾板與漏鬥粘合在一起。反複加熱滅菌和冷卻，容易使濾板與漏鬥壁之間出現空隙，至使濾器不能再用．濾板有多種規格，適於過濾細菌的型號有1 G5 等。上海玻璃廠生產的砂芯漏鬥有1-6 號六種規格，如表2 -5 。

從上述可知，使用過濾器時，必須選好規格，否則不能達到目的．水中細菌往往比陸上的小，尤其是海洋細菌，其平均長度是2-3 微米，寬度是0.4-0.6 微米，小的洋海球菌．直徑僅有0.3 微米，絲狀型的海洋微生物的絲體寬度也小至0.3 微米，故用於除去海洋細菌或其他水中細菌時，過濾器的濾板孔徑要選擇0.3 微米以下的為佳。

表2-5 上海玻璃廠砂芯漏鬥規格與用途

各種濾器在使用前後皆應徹底洗滌於淨。清洗方法如下：

① 新濾器要在流水中徹底洗滌，然後放在1:1000鹽酸水溶液中浸數小時，再用流水洗滌。

② 如過濾物含傳染性細菌或病毒．應將濾器先浸於2%石炭酸溶液2 小時而後洗滌。

③ 矽藻土濾器在使用後應立即洗滌，從反向壓入流水，衝去濾孔中大部分的物質後，浸在2%胰蛋白酶液中，放於37℃ 恒溫箱內24 小時，使殘餘的有機物完全分解，而後用水衝洗，刷淨，測驗好過濾器的可靠性，幹燥後下部用脫脂棉包裹插於濾液接受管上．用九層紗布包後再用牛皮紙包裝，高壓蒸汽滅菌後備用。

濾過後的培養基或其他溶液應放在25-30 ℃ 下3-5 天，如沒有微生物長出則說明過濾器可靠性良好，濾過液無菌，可使用。

3 ．紫外線殺菌法

紫外線的波長為380-200納米．它們都有殺菌能力，波長為260納米左右的紫外線具有最高的殺菌效應。

紫外線對微生物有害作用是由於微生物細胞中的許多物質對紫外線吸收。核酸、嘌呤、嘧啶對紫外輻射吸收能力特別強，DNA 和RNA 的吸收峰為260納米，蛋白質是280 納米。紫外線致死細胞主要是對DNA 的作用，誘導胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑製了DNA的複製，輕則產生突變，重則致死。

（1）應用範圍：紫外線是一種強的殺菌劑．在無菌操作中（如無菌室、接種箱、桌椅及其他用具）和衛生醫療中廣泛地被應用。但透過物質的能力很差，不易透過不透明物質．即使隻隔一層薄玻璃也會被濾去大部分。所以紫外線隻適用於空氣及物體表麵的殺菌。

（2）殺菌方法：對無菌室消毒的時間，視其空間大小和所裝的紫外線殺菌燈的瓦數多少而定一般開燈20-50分鍾．為加強紫外線的殺菌效果，在開紫外線燈前，接種室或接種箱可用5%酚水溶液噴灑，使空中的微生物，塵埃降落，殺死一部分營養體和芽孢。無菌室內的桌椅麵，可用2-3%來蘇爾擦洗。

（3）殺菌效果檢驗：在滅菌後的室內打開營養瓊脂或豆芽汁瓊脂平板培養基5-10 分鍾後，蓋好，置37 ℃ 恒溫箱中培養1-2 天，如果隻有一、二個菌落，可視為效果良好，如果雜菌叢生，則應延長紫外滅菌燈的照射時間或加強其他措施。

在采用物理方法滅菌消毒中，還可應用20 萬周／秒以上的超聲波使微生物細胞破碎致死，也可應用我國試驗成功的靜電除菌法代替過法裝置去除空氣中雜菌等．

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