《水生微生物實驗法》——不同類型微生物的分離方法（4）

（四）海洋固氮菌的分離

絕大多數的水生生物隻能利用一定形式的氮化合物，不能區利用遊離狀態的氮。而固氮菌卻能將遊離狀態的氮變成可供其他生物（如浮遊植物）直接利用的化合物—— 氨的形式。同時，水中固氮是海洋和其他水中氮循環的一個重要環節。氨還能被氧化成亞硝酸鹽或硝酸鹽．水生固氮菌可分為好氧和厭氧兩大類。好氧的有褐色球形固氮菌等屬革蘭氏染色陰性，有鞭毛，常產生象粘液層樣的菌落，這些菌落又可分為兩種，一種是鬆散的彌漫的菌膠團；另一種是較緊密的具有可染色的多糖基質細胞。它們的存在數量隨著水深而減少，但大量生存於海藻、淡水藻、含硫軟泥和含氧量低的海水中。而厭氧性有巴斯德氏固氮梭狀芽孢杆菌，屬革蘭氏染色陽性，周生鞭毛，主要出現於底層水及軟泥中。

固氮作用是在固氮酶的催化下將N₂還原成NH₃ ，進而合成有機化合物。在N₂還原中需要6 個電子和電子供體（如丙酮酸）傳至l 個具低氧化還原電位（-0.43V ）的電子載體―——鐵氧化還原蛋白（Fd ) ，然後經固氮酶的鐵蛋白，再傳至固氮酶的鐵鉬蛋白，最終傳至N₂。，使之還原成NH₃。

 l ．培養基成分及配製

（1）安息香酸鈉（苯甲酸鈉）瓊脂培養基：

苯甲酸鈉l-2 克

CaSO₄·2H₂O  0.1 克

K₂HPO₄   0.2克

MgSO₄·7H₂O   0.2克

NaCl（用於淡水中）0.2克

瓊脂18-20克

水1000毫升

pH7.4-7.6

 在112.6 ℃ 的蒸汽滅菌30 分鍾後，待冷至45℃ 時倒10個培養皿，每個約倒18 毫升。這種培養基對微嗜氮細菌有抑製作用，卻對固氮菌有促進產生黑色素的作用，故對分離純化有利．

（2）阿什比（Ashby ）無氮瓊脂培養基：

甘露醇10.0克

CaSO₄·2H₂O  0.1 克

K₂HPO₄  0.2 克

CaCO₃   5.0 克

MgSO₄·7H₂O 0.2 克

NaCl （用於淡水種）0.2 克

瓊脂18-20 克

水1000 毫升

112. 6℃ 的蒸汽下滅菌30 分鍾．待冷至45 ℃ 時分裝於10個培養皿中，每個18 毫升左右，其中甘露醇可用蔗糖代之．此種培養基能長出微嗜氮細菌，對分離純化有影響。

2 ．分離步驟

（1）分別用不同的取樣器取海水，富含有機質的海底軟泥和汙溝軟泥或汙池泥及海藻。

（2）取後三種樣品各2 克．分別放入裝有5 毫升的無菌水（海中樣品用無菌海水）試管中，搖勻成懸浮液。

（3）因樣品中固氮菌的數量相對來說不多．故分離前須先做加富培養，即用接種環取上述懸液分別點種於安息香酸鈉瓊脂平板培養基上，每板可點種9-12 點。每種樣品再做一份放於缺氧裝置中。

（4）倒置這6 個培養皿於20 ℃ 下，培養5-7天。如在點種的位置有凸起粘稠膠狀的半透明菌落長出即可能是固氮菌。

（5）用接種環分別挑取上述6 個平板上的菌落少許．各自在注明相應樣品編號的新鮮的安息香酸鈉瓊脂平板培養基上劃線分離。

（6）按此法挑相應菌落在新鮮的阿什比平板培養基上劃線分離。每種培養基接種2 份，培養皿應事先編相應代號。

（7）將以上12 個已劃線接種的培養皿倒置於20℃ 下培養5-7 天。（原來屬缺氧培養的應仍放在缺氧下培養）

（8）挑菌落少許塗片．用革蘭氏染色法染色和鞭毛染色法染色．在油鏡下觀察。

（9）將初步確定的固氮菌菌落移種於斜麵培養基上培養，供鑒定研究。

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