《水生微生物實驗法》——不同類型微生物的分離方法（6）

（六）反硝化細菌的富集培養與分離

反硝化細菌的種類很多。它們主要屬於革蘭氏染色負反應，不生芽孢的杆菌，並都屬兼、嫌氣性細菌，在通氣不良的情況下，可完全利用硝酸鹽或亞硝酸鹽中的氧來氧化所需的有機物。即對硝酸鹽和亞硝酸鹽起反硝化作用也就是對它們起還原作用。

1 ．反硝化細菌富集培養

（1）培養基成分及其製備：

KNO₃    2克

檸檬酸鈉5 克

K₂HPO₄ 1 克

KH₂PO₄ 1 克

MgSO₄·7H₂O  0.2 克

陳海水（或蒸餾水）1000 毫升

將上麵成分溶解於水，調pH 為7.2-7.6，分裝於試管或燒瓶．於121 ℃ 蒸汽下滅菌20 分鍾。

（2）接種與結果觀察：在裝富集培養液的試管中分別加少量的海泥或池泥．河泥，在20℃ 或25-30℃ 下培養5-15 天或3-10天。若培養液變混濁，有氣泡產生，說明有反硝化菌生長，或檢驗其有無氨和亞硝酸產生，則可判定是否有反硝化細菌生長．

2 ．分離培養

（1）分離培養基成分及製備．

葡萄糖1克

酒石酸鉀鈉10 克

KNO₃  2 克

K₂HPO₄   0.2克

CaCl·2H₂O   0.5 克

陳海水或蒸餾水1000毫升

將上述鹽類溶於水中，調pH 為7.4-7.6，裝於燒瓶中，121℃ 蒸汽下滅菌20 分鍾．

（2）接種與結果觀察：

① 將上述培養液傾入矽酸膠平板上，於50 ℃ 下烘烤至表麵無水流動，不宜過幹，以免破裂．

② 用富集培養物塗布接種於烘烤後的平板培養基上。

③ 於適溫厭氧條件下培養至長出足夠大的菌落．

④ 觀察菌落形態，作革蘭氏染色，油鏡下觀察其反應及菌體形態．

⑤ 挑取菌落於液體培養基上培養，檢驗其培養基中有無硝酸鹽（用二苯胺試劑檢驗）和亞硝酸鹽（用鋅-碘-澱粉或格裏斯試劑檢查，見硝化細菌的富集與分離）存在，若硝酸根或亞硝酸根消失，可確定所分離細菌屬反硝化細菌．

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