《水生微生物實驗法》——不同類型微生物的分離方法（8）

（八）脫硫弧菌的富集、分離，純化培養

脫硫弧菌屬的分布相當廣泛，在海水和汙水中，特別是海泥漿、汙泥中都很常見。脫硫脫硫弧菌是一種嚴格的厭氧菌，具有還原硫酸鹽能力。

1 ．培養基的成分及製備

（1）巴爾斯氏（Baars ）培養基：

K2HPO4   0.5克

NH4Cl     1.0克

CaSO₄ 1.0 克

MgSO₄· 7H₂O   2.0克

70%乳酸鈉溶液5 毫升

陳海水或自來水1000毫升

將以上鹽類溶解於水，調pH 為7.0-7.5 121 ℃ 蒸汽下滅菌20 分鍾．

另配1%的FeSO₄·（NH₄ )₂SO₄· 6H₂O 的溶液，蒸1 小時，連續蒸3 次，每天1 次。臨用前在每100毫升上述培養基內加入5 毫升的上清液。

此培養基有很多沉澱，不過對於粗放的培養是適宜的。

( 2 ）斯塔基氏（Starkey ）培養基：

K2HPO4   0.5 克

NH4Cl    1.0克

Na2SO4    1.0克

CaCl2·2H2O   0.1克

MgSO₄· 7H2O     2.0 克

70%的乳酸鈉溶液   5.0 毫升

陳海水或蒸餾水1000 毫升

溶解上麵成分，調pH 到7.0-7.5之間，121 ℃ 蒸汽下滅菌20分鍾。

此培養基有少許沉澱，可在滅菌後過濾棄廢，然後再滅菌。

另配l%硫酸亞鐵銨FeSO₄·（NH₄ )₂SO₄· 6H₂O的溶液，臨用前，每100 毫升的培養基內加5 毫升。

2.脫硫弧菌的富集培養

① 先配製20-30%的亞硫酸鈉溶液，過濾滅菌，當需要時，在每100 毫升培養基中加10 毫升，用無菌的1N 氫氧化鈉溶液調pH 為7.2 （每100 毫升巴爾斯氏培養基內約加2 毫升1N 氫氧化鈉溶液）,

② 取2 個30-50 毫升的帶塞瓶．加1-2 克接種物（汙水泥或海泥）於瓶中，在瓶內加滿培養基，上塞，於30-50 ℃ 下培養。

（3）如有黑色的沉澱出現，即為還原硫酸鹽細菌的生長活動，形成黑色的硫化鐵。如果培養數天至幾個星期後．有此現象產生可進行下一步的分離培養。若無，則將樣品按10%比例接種於新鮮的培養基中。

 3 ．脫硫弧菌的分離培養

（1）分離培養基的準備在斯塔基氏培養基內加入2%瓊脂．過濾，滅菌．加亞鐵鹽無菌分裝，每個試管加9 毫升，保持在45-50℃ 的水浴中．

（2）在每管培養基內加無菌的30%亞硫酸鈉溶液l 毫升和已滅菌的1N NaOH 0.2 毫升。

（3）將經富集培養的培養物用上述液體培養基在無氧條件下按10 倍稀釋法稀釋幾個梯度，每9 毫升的液體培養基可預先加入l000ppm 的無菌巰基乙酸1 毫升。

若不用液體培養基稀釋．應吸取較高稀釋度菌液1 毫升滴入有上述培養基的試管中，混勻後靜置。

（4）將接種後的試管培養到在較高稀釋度的管內出現充分分開的黑菌落為止．

另法：在無氧條件下，將富集的培養液分別接種於上述含有亞硫酸鹽和不含亞硫酸鹽的兩種平板培養基上．接種後立即將平板密封於厭氧培養缸內。

4 ．脫硫弧菌的純化培養

( 1 ）波斯特蓋特氏（Postgate ）改進的培養基的成分及配製：

K₂HPO₄   0.5克

NH₄Cl    1.0克

NaSO₄    1.0克

CaCl₂· 6H₂O  0.1克

MgSO₄· 7H₂O   2.0克

70%的乳酸鈉溶液3.5 毫升

酵母膏   l.0 克

FeSO₄·7H₂O  0.002 克

陳海水或蒸餾水1000毫升

溶解以上成分，調pH 為7.5 ，濾去沉澱．分裝，在121 ℃ 蒸汽下滅菌20分鍾。

（2）另用蒸餾水配0.6%鹽酸半胱氨酸溶液，pH 為1.8 , 121 ℃ 蒸汽下滅菌20 分鍾。臨用前按10%比例加入培養基中，半胱氨酸最高濃度為5 微克分子／毫升．

（3）接種挑出經鏡檢形態正確的黑色菌落放於液體培養基中，在好氧條件下培養．

如果是所需菌，可將培養物轉移到相同成分的平板培養基上，在1 大氣壓的氫氣和5%的CO₂厭氧缸內培養，並把一包浸透醋酸鉛的幹脫脂棉放於培養物和他化劑之間。

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