《水生微生物實驗法》——幾丁質分解菌的分離

（十二）幾丁質分解菌的分離

幾丁質也稱殼多糖或稱甲殼素，廣泛地分布於海沙、海泥、海水、淡水和土壤，以及吃幾丁質的頭足類動物的胃腸，蝦、蟹體表中．如幾丁色色杆菌、嗜幾丁杆菌、呈色幾丁杆菌和蝕幾丁芽孢杆菌等。它們將幾丁質分解成中間產物醋酸與還原糖，最終產物為二氧化碳與氨．

1 ．幾丁質培養基製備

（1）幾丁質的製取：洗淨蟹殼或將大海蝦殼浸泡在l%HCl 中7 天，( 2 天換鹽酸溶液1 次）脫去殼的鈣質，使殼變得柔軟而有韌性。然後用水洗淨外殼，剪成1×3 厘米殼條。

用2 %氫氧化鉀溶液浸泡殼條10 天，每2 天加熱一次，加熱的溫度低於沸點為宜，借以除去幾丁質以外的其他物質，如色素和蛋白質等。

用蒸餾水洗淨殼條上的堿，然後用乙醇抽提數次．直到全部顏色脫淨為止。

這樣的幾丁質適用於液體培養基培養未純化的細菌，和保存幾丁質分解菌．

如用於瓊脂培養基中的幾丁質，必須將這種去淨雜質的幾丁質研細分散於培養基中．這可用去雜質的若幹幾丁質條放於3 升的瓶中，在另一個燒瓶中準備好1500毫升冷水，用100 毫升5%的硫酸加到裝幾丁質條的燒瓶中，當幾丁質剛溶解完時，迅速加入已準備好的1500 毫升冷水將酸稀釋，靜置過夜，使幾丁質重新沉澱出來，輕輕倒出上清液．反複離心，洗滌沉澱至使石蕊呈中性。或將幾丁質放在一個透水的玻璃紙袋裏懸掛在流水中，使酸透析完全。

按1：10，使幾丁質重新懸浮於水中。取5 毫升懸液於直徑10 厘米培養皿時，以仍呈輕微而又清晰的乳白色為宜。

將懸液分裝於試管中，每管10 毫升，於121 ℃ 下滅菌15 分鍾。

（2）幾丁質無機鹽培養基製備：

K₂HPO₄   1.0克

MgSO₄·7H₂O  0.5克

NaCl 海水菌用30克   淡水菌0.5克

CaCl₂·2H₂O   0.1克

FePO₄·2H₂O  0.001 克

NH₄Cl 1.0克

H₂O  1000毫升

溶解上列無機鹽類，調pH 為7.0分裝於試管中，每管10毫升，各管加l 條去雜質的幾丁質條，於121℃ 蒸汽下滅菌15分鍾，冷後保存待用，

（3）無機鹽瓊脂培養基：將上述培養基的無機鹽成分全部溶於水後，加入2％的瓊脂（不加幾丁質）加熱溶解之，調pH 為7.0 ，分裝於試管中，分與每管5 毫升和10 毫升的兩種，在121 ℃蒸汽中滅菌15分鍾.

（4）幾丁質瓊脂平板培養基：融化10 和5 毫升的無機鹽瓊脂培養基各若幹管（視實驗要求），於水浴中冷至45℃ 將一份10 毫升培養基倒入無菌的培養皿，靜置．

在5 毫升培養基管中加入0.5 毫升溫熱的幾丁質懸液，充分混和，倒入上麵平皿中的無機鹽瓊脂平板上層。

這種作法能縮短幾丁質分解菌作用子幾丁質的時間。

2 ．幾丁質分解菌富集培養

取樣品接種於含有幾丁質條的上述無機鹽培養基中，在適溫下培養至幾丁質產生明顯的分解後，移種到裝有同樣培養基的試管內，再培養待用。

3 ，分離和純化培養

當分解幾丁質變快時，將無機鹽增菌培養液塗抹或劃線於幾丁質瓊脂平板上，於適溫下培養，待長出菌落後，可挑其菌苔，按一般方法純化，保存於液體培養基中．當幾丁質條接近消失時再移種。

4 ．供參考的培養基

（1）幾丁質瓊脂培養基：

K₂HPO₄  0.7克

KH₂PO₄   0.3克

MgSO₄·7H₂O  0.5克

FeSO₄·7H₂O   0.01克

ZnSO₄   0.001克

瓊脂10 克

蒸餾水1.0升

Ph7.0

以上為基礎培養基，以121 ℃ 蒸汽滅菌20 分鍾、每100 毫升加20毫升膠體幾丁質懸浮液和5 毫克放線菌酮，或製成用於分離放線菌的雙層平板．底層用基礎瓊脂和放線菌酮，上層用膠體幾丁質培養基。

（2）膠體幾丁質的製備：取淨幾丁質15 克加濃鹽酸100 毫升，於冰浴中攬拌20分鍾，離心，將上清液倒入冷蒸餾水中使再沉澱，同時將沉澱物用濃鹽酸再行處理，如此重複數次。最後加足蒸餾水於沉澱物中，攪拌，便成奶油狀，再用氫氧化鈉溶液調pH 至7.0 ，分裝入廣口瓶，每瓶20毫升121 ℃ 蒸汽下滅菌20 分鍾。

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