《水生微生物實驗法》——濾膜法分離檢驗水中大腸杆菌群

（十八）濾膜法分離檢驗水中大腸杆菌群

人們在檢查病原菌汙染的飲用水、近海海水和水源水時，經常以檢查水中大腸杆菌的數量作為指標（我國《生活飲用水衛生標準》 規定：每升水中大腸杆菌不多於3 個，可作為飲用水。）來說明水受人畜糞便汙染的程度。因水中由病人和病畜或帶菌者的糞便汙染而來的病原菌數量很少．不易直接檢查，而水中的大腸杆菌群，如果超過一定數量．就說明被檢查水可能有病菌存在。實際上這種檢查過程，首先是應用選擇性培養基，將大腸杆菌群從雜菌中分離出來的一種過程。

其檢驗方法有兩種：一是發酵法，即根據大腸杆菌群具有能分解乳糖生成CO₂等氣體的特性酶，而其他腸道細菌如誌賀氏菌屬、沙門氏菌屬，由於沒有這種特性酶，不能產氣，可被區別開來。另一種是濾膜法，它是利用細菌不能通過微孔性薄膜．在抽濾下液體濾過而細菌被截留在膜上．然後用具有高度選擇性的品紅亞硫酸鈉培養基（遠滕氏培養基）分離培養，本實驗將應用這種方法分離鑒定大腸杆菌群．此法較簡單而快速，發酵法較之繁雜，所需的時間也較長。

1 ．培養基的成分及製備

（1）品紅亞硫酸鈉培養基：

蛋白腖10克

牛肉膏5 克

酵母浸膏5 克

乳糖10克

瓊脂20克

K₂HPO₄ 3.5克

無水Na₂SO₃ 5 克左右

5 %鹼性品紅乙醇溶液20毫升

蒸餾水1000毫升

（2）儲備培養基的製備：

① 將瓊脂加於800毫升蒸餾水中，加熱溶解後，加磷酸氫二鉀、蛋白腖、牛肉膏及酵母浸膏，混勻，溶解，以蒸餾水補足1000毫升、調pH 為7.2-7.4 。

 ② 趁熱用脫脂棉或絨布過濾後加入乳糖，混勻後定量分裝於錐形瓶中。包裝後於115℃ 蒸汽下滅菌20 分鍾，存於冷暗處備用。

（3）平板培養基的製備：

① 加熱溶化上述配製的儲備培養基。

② 據瓶內培養的數量按2%的比例吸5%鹼性品紅乙醇溶液注入無菌試管中．

③ 同樣按比例（5‰）稱無水亞硫酸納置於滅菌的另一空試管中煮沸10分鍾滅菌後，例入鹼性品紅乙醇液中混合後，全液加到以融化的儲備培養基內，充分混勻（防止產生氣泡）。

④ 立即將此液分裝於無菌培養皿中，製成平板培養基，冷凝後置於冰箱內備用，但不宜存過久。此種培養基專供濾膜法測定大腸杆菌群時用。據使用情況，培養基中鹼性品紅用最也可適當減少。

（4）乳糖蛋白腖半固體培養基成分及製法：

蛋白腖10 克

牛肉膏5 克

酵母浸膏5 克

乳糖10 克

瓊脂5 克左右

蒸餾水1000毫升

將上麵各成分放於水中加熱溶解混勻，調pH 為7.2-7.4 ，過濾，分裝於小試管內，置高壓蒸汽鍋內，115℃下滅菌20分鍾，冷後放冰箱內保存。但存放不宜超過兩周。此培養基製成後．常用已知的大腸杆菌釋菌株作鑒定．應在6 -8 小時後產生明顯的氣泡．

2 ．濾膜與濾器的滅菌

（1）將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水， 於沸水溶中煮沸滅菌三次．每次15 分鍾。前二次煮沸後需換水洗滌2-3 次，以除去殘留的溶劑。

（2）濾器滅菌，用點燃的酒精棉球火焰滅菌，也可用紗布和牛皮紙包裝好於121℃ 蒸汽下，高壓滅菌20 分鍾

3 ．分離培養

（1）過濾水樣（海水、飲用水、自來水，水庫水及各種水源水），用滅菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣，使粗糙麵向上，貼放於已滅菌的濾器上，穩妥地固定好濾器，將水樣注入濾器內，加蓋，打開濾器閥門．在負0.4 大氣壓下抽濾，水樣抽完後，再抽氣5 秒鍾，關上濾器閥門，取下濾器。

（2）用滅菌攝於夾濾膜邊緣，移放在平板培養基上，使濾膜的截留細菌麵向上，另一麵完全緊貼培養基，兩者之何不得留有氣泡，重複以上的步驟，再接種一、二個平板．倒置培養皿於37℃下培養20-24 小時。

（3）觀察。挑選符合下列特征的菌落塗片，革蘭氏染色鏡檢。

紫紅色，具有金屬光澤的菌落．

深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落，

淡紅色，中央色較深的菌落。

④ 凡屬革蘭氏染色陰性、無芽孢杆菌，應將其穿刺接種於乳糖蛋白腖半固體培養基（接種前須將此培養基放在水溶中煮沸排氣，待冷凝後使用），經37℃培養6-8 小時，若沿刺種線有氣泡產生者，則可判定為所分離檢驗的細菌群是大腸杆菌群。

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