《水生微生物實驗法》——噬菌體的分離

噬菌體廣泛分布於自然界中，凡有細菌存在的地方，就有可能有其相應的噬菌體出現，那末就可能從海水、淡水和汙水中，甚至是海泥或海產品中分離到噬菌體．

1 ．水中噬菌體的分離

常用的方法有濾菌器過濾法和加熱法兩種。

（1）過濾法：

取水樣300 毫升．加到100 毫升四倍濃度肉湯蛋白腖培養基內，再加入要分離的噬菌體的相應幼齡（如腸道細菌，經6-8 小時培養）菌液3-4 毫升。在37℃孵育18-24 小時後，以每分鍾2000轉速離正沉澱30 分鍾．上清液經賽氏濾菌器過濾，濾液鑒定．

（2）加熱法：

由於使用濾菌器過濾，常能吸附一部分噬菌體．若液體內噬菌體數量不多時，較難分離成功。而加熱法是根據噬菌體的耐熱性較一般無芽胞細菌高，故用較高的溫度將大部分細菌殺死，噬菌體仍保存著，經過多次反複，使液體中的噬菌體數量增多．最後經過濾器的液體則含有眾多的噬菌體。

分離過程如下：將5-10 毫升汙水加至10-20加毫升肉湯內，混合後加熱56 ℃小時或60℃半小時，取出離心（每分鍾1500轉）沉澱10 分鍾。取上清液2-4 毫升加於5-10 毫升肉湯培養基中，再加幼齡的相應菌液0.5毫升，在37℃ 培養18-20 小時，重新加溫，離心沉澱，取上清液加於肉湯中，加菌液、培養。如此反複3-4 次，最後經賽氏濾菌器過濾，濾液供鑒定。

2 ．噬菌體的鑒定

將已知菌密密地塗布於肉湯蛋白腖瓊脂平板表麵上，取待測的噬菌體液滴於平板上，每板分成三等分，每份1 滴．在37℃ 下培養24小時後．檢查有無透明菌斑出現，以說明濾液中是否含有已知菌的相應噬菌體．

3 ．從貝類中分離純化噬菌體

現已知有100多種病毒可從人或動物腸道，或其他分泌物中排泄出來．而汙染水源，而貝類動物及其他功物能聚集人類致病性病毒．不少學者報道在海水、海洋浮遊生物、海產貝類和汙水中發現，並分離出病毒。Moson 和Moclean( 1962 ）證實了生牡蠣妨內存在著肝炎病毒。由於噬菌體對宿主有高度的特異性．則可利用其宿主作為敏感菌株去培養和發現它們，並根據其對宿主細胞的裂解，可在含有敏感菌株的平板培養基上出現可見的噬菌斑，且一個噬菌體產生一個噬菌斑，一種純的噬菌體具有相同形態大小的噬菌斑，故可將某種樣品中的噬菌體分離與純化。

（1）貝類樣品的處理：取三個活牡蜘，用自來水洗刷貝殼表麵，洗淨後用無菌水洗三次。放於鋪有經高壓消毒的四層紗布的解剖盤上．取無菌解刻刀解剖其肉，無汙染地研磨成漿，加無菌水100 毫升經離心（2000轉／分25分鍾）去沉澱。

（2）增殖培養：取前步驟的上清液，全部加雙倍濃度肉湯蛋白腖培養基100 毫升及所要分離的噬菌體的幼齡宿主，如大腸杆菌、痢疾杆菌或葡萄球菌等懸浮液2 毫升，於37℃下培養12-24 小時。

（3）噬菌體裂解液的製備：

將增殖培養液以2500 轉／分離心15 分鍾，取上清液經蔡氏濾器過濾，並將濾液倒入另一個無菌的三角瓶中，置37 ℃ 下培養過夜．以作無菌檢查．

（4）噬菌體的檢驗：上述濾液若無菌生長，可作有無噬菌體存在的檢驗，其方法如下：

① 將宿主菌懸液塗布接種於肉湯瓊脂平板培養基上。

② 待平板麵菌液幹後，按三等分各滴上1 小滴無菌濾液於平板上。將平板置於37 ℃培養過夜，如果濾液內有相應宿主的噬菌體存在，則加濾液處便無宿主菌生長，而呈蠶食狀的空斑，即噬菌斑，這證明了噬菌體存在。

③ 如已證明有噬菌體存在，可再將濾液接種於已同時接種有宿主菌的肉湯培養基內，如此重複移種數次，即可使噬菌體增多。

4.純化培養

（1）將含有噬菌體的濾液用肉湯液體培養基，按10倍稀釋法稀釋成10^-1-10^-5等5 個稀釋度。

（2）向裝有4 毫升已融化的，保溫在50℃左右水浴箱中的瓊脂管加0.1毫升宿主杆菌液，並對號加入0.1毫升各稀釋度的濾液，搖勻。然後，對號傾入直徑為9厘米的裝有10 毫升已凝固的底層瓊脂平皿上．

（3）待倒入的上層瓊脂凝固後．置於37℃培養18-24 時。

（4）待出現噬菌斑後，用接種針在選定的噬菌斑刺一下，接種於含有宿主菌的肉湯培養液中，於37℃ 培養18-24 小時，再依上述方法稀釋．倒平板分離，直到平板上出現的噬菌斑形態大小一致．則表明已獲得純化的，相應於宿主菌的噬菌體。

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