淋球菌保存方法的實驗研究

摘要：  

目的  為了經濟、簡便地貯藏淋球菌以利於對淋球菌進行研究，我們特對目前幾種保存淋球菌的方法進行比較實驗，以便找到最理想的貯存方法。  

方法  用鮮奶法、脫纖維血法、普通奶粉法和冷凍真空幹燥法四種方法同時保存85株淋球菌。  

結果  冷凍真空幹燥法一年和二年內複蘇，複活率均為100％； 鮮奶法一年內複蘇，複活率為100％， 二年內複蘇，複活率為97．7 ％， 脫纖維血法一年內複蘇，複活率為100％，二年內複蘇，複活率為82．3 ％，上述三種方法明顯高於普通奶粉法組( 9.4 ％， 1.2％) ，差異均具有顯著性( P<0.01 ) 。  

結論  鮮奶法保存淋球菌具有經濟、簡便實用、存活率高等優點，是一種較理想的貯存淋球菌的方法。短期(一年內) 脫纖維血法也是一種較理想的貯存淋球菌的方法 。 

 

 

淋病奈瑟菌又稱淋球菌 (gonococcus ) ，是引起人類泌尿生殖道急慢性炎症的主要性傳播疾病之一，為我國目前流行的發病 率極高的性傳播疾病病原，其培養要求很高，實驗室常規保存極其困難，這給科研和教學帶來諸多不便。目前，淋球菌保存一般采用傳統的冷凍真空幹燥法，此法雖然可靠，但操作繁瑣費時，需要貴重儀器一冰凍幹燥機和真空泵等，成本較高。 如何簡單而又可靠地長期保存淋球菌，一直是廣大科研工作者關心的課題，已報告的菌種保存方法有多種，但是對營養要求苛刻的淋球菌，哪種方法最理想呢?為此我們經過多年大量實驗，得出了一種最實用可靠的淋球菌培養保存方法，現報告如下 。 

1   材料與方法

1.1 淋球菌菌種  共85株， 其中 8 4株為本院2001-2005年性病門診患者泌尿生殖道分泌物中的分離菌，1株標準株，標號為 ATCC49226 。 

1.2新鮮奶保存液的製備  用無菌1000ml 三角瓶在奶牛場現場取鮮奶500ml ，巴氏消毒 ( 62℃ 30 min ) 消毒脫脂三次加0.1 ％葡萄糖、5％胎牛血清，用0.1NNaHCO₃調pH至7.4分裝於小試管，每管0.5 ml，加橡皮塞 4℃保存備用。 

1.3 普通奶粉保存液的製備  取南山牛奶粉 200g ，加無菌蒸餾水500ml 搖勻，巴氏消毒法消毒脫脂三次，加0.1 ％葡萄糖5％胎牛血清 ，用0.1NNa HCO₃調pH 至7.4， 分裝於小試管和菌種管，每管0.5ml，加橡皮塞4℃保存 。 

1.4脫纖維血保存液的製備  用無菌手續抽取羊頸靜脈血注入已滅菌的帶玻璃珠瓶中以脫去纖維，然後分裝加蓋無菌小試管中，每管約2 m1，加橡皮塞 4℃保存 。 

1.5 血消化液淋球菌選擇培養基製備    血消化使用液1000m1， 氯化鈉5.0 g，玉米澱粉 1.0g， 純化瓊脂14.0 g， 高壓蒸汽滅菌，冷卻至80℃～90℃時加7％綿羊血( 或兔血)，邊加熱邊搖動至咖啡色，55℃時加以下添加劑：0.15％葡萄糖，7.5 mg／L多粘菌素B， 3 mg / L萬古黴素和12500 u／L製黴菌素，搖勻傾注平皿，3 7℃2 4 h作無菌實驗，並接種已知淋球菌，置5％CO₂ 孵箱(若沒有CO₂孵箱，可用燭缸法：置於幹燥玻璃缸，點燃蠟燭用凡士林封口密閉容器，待蠟燭熄滅相當於5％～10％CO₂ 培養)35℃  24～48 h作質量鑒定， 合格者供用。也可用其它商品化淋球菌培養基，如GC培養基、TM培養基、New York培養基等  。 

1.6 淋球菌的複蘇與保存  按全國臨床檢驗操作規程，先將85株淋球菌接種在血消化液淋球菌選擇培養基平皿上，5％CCh孵箱(若沒有CO₂孵箱，可用燭缸法：置於幹燥玻璃缸，點燃蠟燭用凡士林封口密閉容器，待蠟燭熄滅相當於5％～1 0％ CO₂ 培養) 3 5℃ 2 4 ～4 8   h複蘇， 然後用接種環挑起菌落放入上述試管和菌種管中，充分磨勻，將三種含有淋球菌的小試管加橡皮塞後置-70℃冰箱中凍存。將含種有淋球菌的菌種管，先用冷凍幹燥機快速凍幹，然後用真空泵和酒精噴燈密封菌種管，4℃冰箱保存。一年和二年後用同樣的方法開啟用上述三種方法保存的85株淋球菌，每株每種方法複蘇三支菌 ，觀察淋球菌複蘇情況， 計算淋球菌平均存活率。 

1.7統計學處理所得數據用χ²檢驗行統計分析 。 

2 結果

采用四種方法保存85株淋球菌，一年、二年複蘇存活率， 冷凍真空幹燥法均為100％； 新鮮牛奶法分別為100％和97.7％；脫纖維血法一年內複蘇，複活率為100％，二年內複蘇， 複活率為70.9％，普通奶粉法分別為9. 4％和1. 2％。前三種方法之間差異無統計學意義 ( P>0.05 )，但三者與普通奶粉法比較， 差異均具有統計學意義 ( P<0.01 )，見表1 。 

 

 表 1   四種保存淋球菌方法一、二年存活率比較

 

 

 注 ： VS#P>0.05， *VS@ P>0.05 ， # VS@ P >0.05 ， *、 #或@V S 普通奶 P <0.01 

3   討論

從四種保存淋球菌方法的結果來看，用傳統的冷凍真空幹燥法淋球菌存活率為100％， 此法是先將微生物在低溫中迅速冷凍，然後在高真空狀態下迅速脫水幹燥，真空密封而成。幹燥細菌或病毒時常用脫脂牛奶做保護劑，這種方法可維持微生物生命達數年之久 。但此法操作繁瑣、費時、費力，需價格昂貴的冷凍真空幹燥機和真空泵等設備，故成本較高，給實際工作帶來諸多不便。普通奶粉法，其主要成份雖為牛奶，操作也簡便，成本低，但奶粉在加工處理過程中可能有些營養成分被丟失或增加了某些添加劑(成份變化有待進一步檢 測)，不利於營養要求較高的淋球菌的代謝，實驗結果顯示其一年和二年存活率僅為9.4％和 1.2％，與冷凍真空幹燥法比較，差異顯著有統計學意義( P<0.01)。脫纖維血法，本身就含有血的成份，無需添加其它營養成份，操作簡單，經濟實用，一年存活率為100％，但二年存活率下降較大，隻有82.3％，因而此法保存淋球菌株最好不超過一年，短期保存淋球菌菌株， 此法值得推廣。鮮奶法，牛奶未經工業加工處理，營養成份基本上未丟失，無任何添加劑 ，  並添加了適量的葡萄糖和胎牛血清，有利於淋球菌的代謝，-70℃冰箱保存，一年、二年內存活率分別為100％和97.7％，與冷凍真空幹燥法比較，差異無顯著性( P>0.05 ) ，此法操作簡單易行，經濟實用，保存細菌存活率高，是一種較為理想的淋球菌保存法，具有較高的推廣價值，特別適用於從事淋球菌研究的科研和教學單位。而對於基層醫療單位實驗室條件有限，脫纖維血法和鮮奶法保存淋球菌更是非常適用的方法。 

眾所周知，淋球菌是一種比較嬌嫩的細菌，營養要求極高，比較難培養和保存。一般來 說 ， 適宜淋球菌生長的培養基其它細菌基本上能生長，是否可以推測保存淋球菌的鮮奶法和脫纖維血法也可用於其它細菌的保存，有待進一步研究。另外，本實驗僅觀察了二年內的數據，鮮奶法是否能保存二年以上還有待 進一步探討。而脫纖維血法保存最好不超過一年。