新疆奎屯地區高砷環境中抗砷菌的初步篩選

【摘要】  

目的     初步篩選新疆奎屯地區高砷環境中(123團4連)自流井水和汙水中存在的高抗砷菌，檢測其抗砷能力。

 

方法     選擇高砷自流井水和汙水標本，在NaAsO₂選擇性培養基上，分離和純化，篩選出抗砷菌，初步進行細胞形態學的鑒定；用不同Na AsO₂濃度的L B培養基對菌株抗砷性進行檢測，測定其抗砷水平。

 

結果     初步篩選出5株抗砷能力較強的抗砷菌。A1、A2、A3均為革蘭氏陰性杆菌 。 Bl、B2均為革蘭氏陽性球菌；5株菌均可在含有NaAsO₂ (50-400 mg／L) 培養基中生長。最高耐受到400mg／L，是新疆奎屯高砷水含量實際最高值的517倍，最低值的1156倍。  

 

結論     ①經初步篩選確認新疆奎屯地區高砷環境中的自流井水和汙水中存在高抗砷菌，首次成功篩選出5株強抗砷菌。②A 1菌株的抗砷能力最強，可在400mg／L  Na AsO₂ 的 LBA培養基上生長。本研究為新疆地區抗砷菌的深入研究提供了基礎資料。

 

    砷 (arsenic ) 俗稱“ 砒霜” 是自然界中廣泛存在的有毒物質。通過自然環境中存在砷含量高的水和土壤，可使當地居民因攝人過量的砷而引發地方性砷中毒。目前世界上不斷報道新出現的砷汙染，新疆奎屯墾區是我國大陸上首次發現的地方性砷中毒病區，受害居民10萬人．經過20年堅持不懈的防病改水幹預措施．使該病區在地方性砷中毒的防治方麵取得了顯著成效。利用生物技術防止汙染、改造環境是當今世界提倡“綠色”環保的一個研究方向．因此對氟砷汙染地區利用微生物技術改造也自然成為一個新的研究熱點。新疆是氟砷中毒高發區，奎屯墾區氟砷中毒最為嚴重。該地區為新疆地勢最低窪地，天山山脈富有含氟砷礦物，提供了氟砷來源。其獨特的地理環境存在著豐富的微生物研究資源。由於高氟砷水多埋藏於地下深處，因此從新疆奎屯地區高砷環境中的自流井水和汙水中尋找高抗砷菌，具有可能性和重要實用意義。目前新疆在抗砷菌的研究方麵還是空白．本實驗從新疆奎屯地高砷水環境中篩選出多株抗砷菌，並進行了形態學檢驗和抗砷能力的測定。為新疆地區抗砷菌的深入研究及以後采用微生物治理水環境汙染問題提供寶貴的基礎研究資料。 

 

1 材料與方法

1.1材料

 

1.1.1研究對象    2008年3月采集新疆奎屯地 (123團4連) 高砷自流井水和汙水。研究對象納入標準：根據新疆公衛學院提供的資料，分別取123團4連的砷汙染最嚴重的自流井水 ( 砷0.347± 0.773 μg／L )  和附近的汙水為分離、培養標本。

 

1.1.2標本采集    采用100 ml的無菌玻璃瓶，嚴格無菌操作，分別用50m l的一次性無菌注射器抽吸自流井水和汙水後，置於無菌瓶中。做記錄後，將無菌瓶置於冰袋中，盡快送實驗室進行分離培養。 

 

1.1.3主要儀器與試劑   哥倫比亞瓊脂、N aAsO₂、電熱恒溫三用水浴箱、高壓蒸汽滅菌鍋、 超淨工作台、電冰箱、核酸／蛋白分光光度計( BIO—RA D美國)、電熱恒溫培養、SIM—F124雪花製冰機(日本三洋) 、O1ympus BH2顯微鏡( 德國) 等。 

 

1.2方法

1.2.1抗砷菌的分離與純化     根據文獻中記載的方法操作如下：

 ①取自新疆奎屯高砷環境中自流井水和汙水標本，在無菌三角燒杯中分別加入8ml  0.85％NaC1 ， l ml 井水樣本， l ml 亞砷酸鈉母液，在另一無菌三角燒杯中分別加入8 m l 0.85 ％NaCl ，l m l汙水樣本，  l m l 亞砷酸鈉母液( NaAsO2 濃度為 1.33mol／m1 ) ， 靜置 5—6 d ，27℃恒溫箱培養至穩定期( 7 d左右) ；

 

 ②取原菌液，按不同梯度稀釋 (10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5 ) ， 稀釋終濃度 10^-5，用移液器取100μl在LBA平皿中用接種環劃線，靜置15min後，倒置放入27℃恒溫箱中培養24～ 72 h。挑取單個菌落接種到LBA培養皿中，進行純化培養，獲得菌株，並保存菌種；

 

③將純化培養的菌株再接種於哥倫比亞瓊脂平板進行細菌培養5—7d，挑取可疑菌落，做革蘭染色，油鏡鏡檢，見革蘭染色陰性(紅紫色)，革蘭染色陽性(紫色) 。 

 

1.2.2抗砷菌的細胞形態學鑒定包括革蘭氏染色，油鏡鏡檢。 

1.2.3高抗砷菌菌株的篩選    篩選LB培養基：蛋白腖10g ，酵母粉5g，NaAsO₂濃度按照 50mg／L、100mg／L、200mg／L、300mg／L、400mg／L、500mg／L設置。用移液器取0.1μl 純化培養的抗砷菌在平皿劃線，28℃培養，搖床過夜，挑取單個菌落反複劃線純化， 得到相應濃度NaAsO₂培養基中生長的菌株。純化好的菌株-20℃保存，以便後麵研究使用。

 

1.2.4菌株的抗性實驗   分別將抗砷菌A1、A2、A3、Bl、B2培養過夜，以1％的接種量接種在含有不同濃度亞砷酸鈉的LB液體培養基中，在28℃搖床中搖菌，培養16h～18h，600nm波長下測定菌液OD值，確定NaAsO₂ 的最小致死濃度和最大抗砷濃度。大腸杆菌標準菌為陽性對照菌株 。 

 

2 結 果

2.1   5株抗砷菌菌株 A1、A2、A3、B1、B2形態特征觀察     本研究共分離出新疆奎屯高砷水環境抗砷菌菌株5株，其中革蘭氏陰性菌3株，以杆狀為主。革蘭氏陽性菌2株，以球形為主，在28℃恒溫箱培養48～72 h才形成菌落，這些菌落以直徑大，圓，濕潤，隆起， 半透明，淡黃，粉紅，桔黃色，金黃色，為主，菌種形態見表 l。 

 

表 1 初篩的5株抗砷菌基本形態特征

 

 

2.2 菌株的抗砷實驗     結果NaAsO₂ 濃度按照50mg／L 100 mg／L 200mg／L  300mg／L、400mg／L  500 mg／L設置。非抗砷菌大腸杆菌作為陰性對照。 Al菌株的最大抗砷濃度為400mg／L  NaAsO₂；其餘4株的最大抗砷濃度為300mg／L  NaAsO₂ 。大腸杆菌標準株在50 mg／L  Na AsO₂ 生長16 h全部死亡，見表2。 

 

表 2    菌株的抗砷實驗結果

 

 

3 討論

       隨著科學技術的發展，一些特殊環境下的細菌已經顯示出重要的地球化學意義及突出的環境學領域的應用前景。有研究表明。像易對抗生素產生耐藥性一樣，微生物會對很多金屬離子(如As、Pb、Cu、和Zn等) 產生抵抗作用。古生物正是為了排除有毒金屬砷、鉛、鎘和保持所需的金屬元素銅、鋅的穩定性，在生物進化中形成了維持金屬離子的內穩定性和解毒機製 。 

 

       砷廣泛分布於自然界的大氣、水和土壤中，是一種毒性很強，且有累積中毒作用的類金屬元素．土壤及飲用水被砷汙染後會引起嚴重的健康問題。砷汙染引起的中毒世界各地均有報道，以孟加拉、美國中南部、印度、西班牙，意大利、中國最為嚴重。在美國東北地區的飲水中，砷含量超過 50ug／L，對健康造成嚴重的威脅，但在調查這些地區微生物時卻發現這些生物體內都有一套完整的排除毒性金屬離子的完整轉運體係。目前研究己分離出砷黴菌等l1個係的異養細菌具有釋放砷的作用．它們能使無機態砷化物轉化為有機態砷化物和砷化氫出逸出土壤，達到消除砷害的目的。近幾年，隨著基因工程的迅猛發展，各國對細菌抗砷基因的研究也不斷深入，在基因水平上發現其對砷有一定抗性和解毒功能。抗砷菌的研究對於應用微生物技術治理改善高砷環境中水砷汙染有著及其重要的意義。

     

       新疆奎屯高砷環境自流井水和汙水中高抗砷微生物應當是相當豐富的，我們的研究還是初步的。首次僅分離出5株抗砷菌．大量的高抗砷菌還需我們繼續發現和研究。 國外不斷有報道發現原核生物的抗砷性可隨細菌質粒在菌株間轉移．在其質粒和染色體上陸續發現了抗砷基因，從而引發了對抗砷質粒的研究。我們對已發現的抗砷菌株還需進一步明確屬和種、 生物化學特性，分析遺傳背景，確定抗砷基因並克隆。