分子生物學在微生物檢驗中的應用

    21 世紀是以分子生物學為代表的生命科學的時代，近年來,隨著現代生物技術的快速發展,人類基因組計劃的完成,尤其是生物化學、免疫學、生物儀器及計算機理論與技術的進步，分子生物學技術在醫學、遺傳學、法醫學、生物學等各個領域廣泛應用, 新的診斷技術和方法不斷湧現並被廣泛應用於微生物檢測，為傳染病的流行病學調查、基因的多樣性、微生物的生物學特性、微生物的致病性和藥物的耐受性、微生物的生物降解能力等各個方麵提供了重要的信息。

 

      最初應用於微生物檢測的分子生物學技術是基因探針方法,它是用帶有同位素標記或非同位素標記的DNA 或RNA 片段來檢測樣本中某一特定微生物核苷酸的方法。核酸雜交有原位雜交、打點雜交、斑點雜交、Sorthern雜交、Northern雜交等,核酸分子探針又可根據它們的來源和性質分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡聚核苷酸探針等。其原理是通過標記根據病原體核酸片段製備的探針與病原體核酸片段雜交,觀察是否產生特異的雜交信號。核酸探針技術具有特異性好、敏感性高、診斷速度快、操作較為簡便等特點。目前,已建立了多種病原體的核酸雜交檢測方法,尤其是近年來發展起來的熒光原位雜交技術(FISH) 更為常用。

 

      細菌質粒分析是較早被使用的對病原微生物流行病學進行調查的分子分型技術。這種技術包括萃取質粒DNA ,通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA。由於不同菌株質粒DNA序列和大小不同,通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA質粒圖譜也將不同,因此,與流行病相關的分離株能夠被分類分型。質粒圖譜分析的再現性和分辨力可通過限製性內切酶消化質粒而提高。雖然2個不相關質粒有相同的分子量, 但性內切酶位點的位置和頻率是不同的。但質粒是可移動的非染色體遺傳物質,細菌能自發的失去或很容易的獲得,結果流行病相關的菌株可以展示不同質粒指紋圖譜。許多質粒帶有抗性決定因子的基因,存在於轉位子上,而轉位子很容易丟失或獲得,這同樣可以迅速改變質粒DNA組成。產生圖譜的再現性也會由於質粒空間存在的不一致性(超螺旋的、斷口的和線形的)而被影響,而凝膠電泳時具有不同遷移速度。大多數病原微生物有質粒,但沒有質粒的就不能用此技術分型。此外,由於有些分離株中含有1個或2個質粒,會使菌株間的分辨力降低。

 

       染色體DNA經限製性核酸內切酶消化,消化後的片段再通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離。用限製性內切核酸酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因組DNA可以產生大量短的片段。電泳後,將獲得一係列被分離的DNA圖譜。通過比較圖譜,就可以進行菌相似性研究。幾乎所有的病原微生物分離株都可以通過這種方法分型,但由於基因組DNA巨大,酶切後產生的片段眾多,且含有大量的重疊片段,這將導致菌株間圖譜一致性分析產生困難。但若細菌隻含一個或少量核糖體操縱子, 則隻產生1～ 2條帶, 這限製區分密切相關菌株的能力。RFLP分析分辨力低於脈衝場凝膠電泳分型技術（PFGE）, 且比較複雜圖譜(數百條帶) 的難度較大。

 

      脈衝場凝膠電泳分型技術（PFGE）是使用對染色體有很少酶切位點的限製性核酸內切酶消化細菌DNA ,產生大的DNA片段(10～800 kb) ,這些大片段不能通過常規電泳方法進行有效分離。在電場方向周期改變(脈衝)的凝膠電泳條件下,DNA片段根據大小有效分離。PFGE產生的染色體DNA圖譜比用那些高頻率切割的限製性內切酶產生的圖譜更為簡單清晰。理論上,所有的細菌都能使用PFGE 進行分型分類,結果具有極高的再現性和分辨率, 常作為分子生物學分型方法的“金標準”使用。PFGE 也有一些局限,例如所需時間長,使用的試劑非常昂貴,要求專門的儀器等。另外,很小的電泳條件的不同就可以改變每條光譜帶間距離,使用不同凝膠進行電泳得到的結果也比較複雜,這為不同實驗室間的結果比較帶來一定麻煩。

 

      聚合酶鏈反應( PCR)技術自1985年發明以來,因其高度靈敏性和良好的特異性受到了人們的高度重視,各種各樣以PCR 為基礎的DNA序列的擴增和檢測方法得到了迅猛發展,幾乎已應用於基礎研究的各個領域。各種衍生技術如反轉錄PCR ( RTR) 、多重PCR 、巢式PCR、PCR單鏈構象多態性(PCRSSCP)、限製性片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增的多態性DNA 技術(RAPD)和重複序列PCR技術(Rep - PCR)、熒光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用於臨床感染性疾病的診斷,又可用於監測其療效，PCR及其衍生的技術近年來在病原微生物分型研究上得到了廣泛應用。

 

      隨機擴增的多態性DNA 技術（RAPD）是一種典型PCR衍生技術, 在低複性溫度下用短任意序列引物( 10～15m ers) 擴增有密切同源性的基因組DNA序列, 模板上任意引物雜交點的數目和位置因種的不同株而異, 理論上特定株形成特定圖譜。基因組在這些雜交區段如發生了DNA片段缺失、插入或堿基突變,就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化。通過電泳對擴增產物DNA片段的多態性進行檢測、分析就可以反應出不同菌株基因組的DNA特點,從而對他們進行分型，RAPD是目前最簡單的DNA分型方法, 分辨力高於RFLP, 但低於Rep－PCR，RAPD技術的使用範圍也非常廣,分辨結果也有較好的實驗室再現性。雖然RAPD技術簡單、快速, 但由於其對引物和DNA濃度、DNA模板質量、凝膠電泳和DNA聚合酶類型的變化高度敏感, 故RAPD的重複性不夠理想。雖然RAPD的分型結果在不同實驗室間變化較大,分辨力不如PFGE技術,但在疾病暴發流行時,PAPD仍是一種分析相關菌株和排除不相關菌株的良好技術。

 

      重複序列PCR技術（Rep－PCR是利用細菌基因組中廣泛分布的短重複序列為引物靶序列,進行PCR擴增,通過對PCR產物電泳結果的比較,分析菌株間基因組存在的差異。這些重複序列在原核生物界廣泛存在,在一些細菌屬和種中是保守的。在這種方式獲得的圖譜中,光譜帶的大小和數量的不同代表著不同菌株重複序列間的距離和重複序列的數量。已成功地用於分型的細菌重複DNA序列有腸道菌重複基因間共有(ERIC) 序列、重複基因外回紋序列(REP)和BOX序列的分析，與其他分類技術相比,這種技術有更高的分辨力。研究表明,雖然有時Rep-PCR分辨力稍低,但與PFGE獲得的結果卻有很好的相關性。

 

      免疫PCR(immuno polymerase chain reaction ,IM PCR) 是1992 年Sano 等建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術。該技術把抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性有機結合在一起,它的基本原理是用一段已知DNA分子標記抗體作為探針,用此探針與待測抗原反應, 用PCR擴增粘附在抗原抗體複合物上的這段DNA分子,電泳定性,根據特異性PCR產物的有無,來判斷待測抗原是否存在。目前,國內外報道的免疫PCR的敏感性一般比現行的ELISA 法高10² ～10⁵ 倍。由於PCR產物在抗原量未達到飽和前與抗原抗體複合物的量成正比,因此免疫PCR 還可用於抗原的半定量試驗。

      PCR－ELISA是PCR與ELISA技術結合的檢測方法，其綜合了PCR、分子雜交和ELISA三種技術的優點，主要用於檢測樣品中的特定基因。它引入地高辛(或生物素) 標記的dNTP或引物進行PCR擴增,利用酶標抗地高辛抗體(或酶標記親和素) 進行ELISA檢測,代替了用於常規PCR產物檢測的電泳方法,方便快捷,易於處理大量樣品,且其靈敏度比使用瓊脂糖凝膠電泳檢測方法高100倍,當有適當的標準品時,還可進行定量測定。

 

      與檢測全染色體的PFGE、Rep－PCR和RAPD分析相比,DNA測序隻檢測細菌或真菌株間潛在變化序列的很小一部分。用於辨別菌株的被測序DNA區域必須滿足以下條件:DNA區的結構必須是可變序列，兩側為高度保守區;DNA序列的可變性必須能足以區分特定種的不同株;DNA序列不能水平轉移到其它株。對細菌和真菌, 極少序列滿足這些條件。相反,DNA測序被認為是病毒分型的 “金標準” 。DNA測序費用高、需要很高的技術條件, 而且自動化DNA 測序儀十分昂貴。

 

      自Woese 等於1987年首次運用rRNA分析以來,rRNA數據庫快速擴大起來,成為研究細菌多樣性、進化、係統發育中被廣泛采用的序列。16SrRNA存在於所有原核生物細胞中,它們相對穩定且有較高的拷貝數(每個細胞幾千個拷貝) ,其序列中含可變區及高度保守區,因此可設計群、屬、種特異性的探針。現階段各種常見細菌的16SrRNA基因幾乎全部測序完成,16S rRNA編碼基因的這些特點使之成為較理想的細菌基因分類的靶序列,逐漸成為細菌鑒定、分類的“金標準”。目前, 16SrRNA 檢測技術已在醫學界得到廣泛應用,可以用現有病原菌標準菌株製作DGGE(變性梯度凝膠電泳) 標準marker , 然後對疑似“病原菌”擴增16SrRNA進行DGGE分析,這樣可以做到快速檢測。

 

八．生物芯片

      生物芯片技術是將生物大分子,如寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如矽片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質上形成生物分子點陣,當待測樣品中的生物分子與生物芯片的探針分子發生雜交或相互作用後,利用激光共聚焦顯微掃描儀對雜交信號進行檢測和分析。微生物檢測基因芯片是指用來檢測樣品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片。基於高通量、微型化和平行分析的特點,微生物檢測基因芯片在微生物病原體檢測、種類鑒定、功能基因檢測、基因分型、突變檢測、基因組監測等研究領域中發揮著越來越重要的作用。目前,許多細菌、病毒等病原體的基因組測序已經完成,將許多代表各種微生物的特殊基因製成1張芯片,經反轉錄就可檢測樣本中有無病原體基因的表達及表達水平,由此判斷病人感染病原、感染進程以及宿主反應等。這樣就大大提高了檢測效率。基因芯片診斷病原菌的原理基於細菌的16SrRNA基因的高度保守性,由於RNA易於降解,因此多采用檢測16SrRNA 所對應染色體上的16SrDNA序列。對16SrDNA而言,如果出現3 個堿基以上的差異就可以斷定細菌不屬於同一種屬,因此可用於細菌的分類和鑒別。對病毒和耐藥性病原菌的檢測是通過將待測的特定基因(病毒特異性基因和耐藥基因) 經體外轉錄、PCR、逆轉錄、末端標記等處理成標記有熒光分子的核酸分子,然後與芯片上的探針進行雜交,用計算機對雜交信號進行處理,依信號和強度即可得出核酸含量。

      液態芯片（Suspension Array Technology，SAT），又稱微球蛋白芯片（Protein Bead arrays，PBA），是近年來出現的一種新的芯片技術，也是唯一被美國食品和藥品監督管理局（FDA）批準的用於臨床診斷的生物芯片。其原理是用兩種熒光染料按照不同比例將直徑為5.6um的微球（beads/microfluorospheres）染成100種染色，每種顏色的微球共價結合一種生物探針，可以是抗原、抗體、配體，也可以是核酸或酶，分別針對一種待檢物。混合載有100種不同顏色的微球，就可以在一個反應孔裏同時完成100種不同的生物反應。隨後微球成單列通過兩束激光照射的管道，計算機采集並處理每種顏色微球的熒光強度變化就可以分別對每個待測物進行定性或定量的檢測，該係統可用於多種微生物抗原、抗體和特定基因的聯合檢測，與固態芯片相比，液態芯片在反應動力學、反應速度、檢測敏感性、穩定性以及自動化程度方麵都有較大的優越性，因此不少學者看好液態芯片的應用前景。

 

      生物傳感器是將新興的傳感器技術和分子診斷技術相結合而成的一種新技術,是現代臨床檢驗診斷發展的一個新方向。由於生物傳感器檢測準確、操作簡便等特點,近年來已經在許多領域取得了很大的進展,在生物分子相互作用、藥物篩選、臨床診斷、食物檢測等領域獲得了廣泛的應用，其中臨床中用於病原體檢測的以DNA生物傳感器最為常見。盡管生物傳感器作為一種新的傳感元件近年來得到了很大的發展,許多光化學、電化學以及壓電晶體都相繼在生物傳感器中得到應用。與常規的核酸和蛋白質檢測相比,具有檢測準確、操作簡單等特點,但由於它存在靈敏度不夠、容易受雜質幹擾等缺點,隨著研究的進一步深化和技術方法的改進,這些問題將會得到解決。

 

      蛋白質指紋圖譜技術是隨著蛋白質組學興起的一種新技術，其中表麵增強激光解吸電離飛行時間質譜蛋白芯片技術(SELDI-TOF-MS，下稱SELDI-TOF-MS) 是由T. William Hutchens 和 Tai-Tung Yip等科學家在上世紀90年代早期所創立的一種蛋白指紋圖譜分析技術，並獲得了2002年諾貝爾化學獎，為研究蛋白質的結構、屬性、功能提供了高效而可靠的技術平台。其原理是利用各種方法（共價鍵、電荷等）將蛋白“富集”到芯片表麵，在激光的轟擊下，蛋白解吸附並電離成帶電粒子，並在電場作用下飛行，其飛行單位距離的時間取決於其所帶電荷數量和其分子量之比（質荷比），從而達到分離和分析蛋白質的目的。該技術是目前最有前途的比較蛋白質組分析方法，為蛋白質組學研究提供了一個利器，具有獨特的優勢和能力：可直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進行分析、可同時快速發現多個生物標記物、具有高通量的驗證能力、能發現低豐度蛋白質（靈敏度高達fmol/ml），與“雙相電泳加飛行質譜”相比，除了有相似功能外，並可增加測定疏水蛋白質，可在同一係統中集發現和檢測為一體，SELDI在微生物檢驗方麵將發揮重要的作用。

 

      1990年,Tuerk和Gold^[1]分別獨立研製了一種新型的體外篩選技術,即指數富集的配體係統進化技術(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment, SELEX),用於研究小分子核酸與靶物質相結合的部位、序列及空間構像。適體（aptamer），又稱適配分子或適配子，實質是運用SELEX技術從人工體外合成的隨機寡核苷酸序列庫中反複篩選得到的能以極高的親和力和特異性與靶分子結合的一段寡核苷酸序列。

      由於適體分子可用酶、放射性核素、熒光物質及生物素等標記以作為檢測分子，它協同傳統的單克隆抗體在流式細胞技術、生物傳感器、熒光偏振、分子燈塔和毛細管電泳等檢測技術上得到了廣泛的運用。

      適體與抗體相比，具有針對靶分子的範圍廣、親和力和特異性高、性能穩定、便於修飾等諸多優點。利用針對微生物的特定蛋白和基因的適體對微生物進行鑒定和分型以及耐藥基因的檢測方麵，適體將具有良好的前景，有的學者認為，未來適體有可能取代抗體。

 

 

      長期以來,人們試圖找到一種既簡便又快速、又有足夠分辨力的技術來鑒別和區分各種病原微生物，各種新方法和新技術不斷湧現，但每一種方法都有其局限性，為了彌補各自的不足，使用一種以上的技術即采用多種方法聯合使用的策略,一種技術的缺點會被其他技術的優點所代替。選擇檢測方法應考慮到自身所擁有的條件,檢測所要求達到的靈敏度,而提高靈敏度和去除假陽性是檢測方法發展的趨勢。近年來,隨著計算機技術的不斷發展,臨床病原菌檢測將向著簡便、快速、高通量、自動化的方向發展。分子生物學技術通過自動化儀器的使用,將在病原菌診斷、鑒定和耐藥基因檢測方麵越來越廣泛地應用於臨床。