羊梭菌病多聯滅活疫苗生產用厭氧培養基的研究

1  新疆畜牧科學院獸醫研究所，新疆烏魯木齊  830000

2  新疆天康畜牧生物技術股份有限公司生物製品事業部，新疆烏魯木齊  830013

 

關鍵詞：厭氧菌培養基；肉肝胃酶消化湯；產氣莢膜梭菌（B型、D型）；腐敗梭菌；培養試驗；毒素

 

     梭菌性疾病是由厭氣梭菌屬中多種梭菌引起的一類各種動物的傳染病，如快疫、猝狙、痢疾、腸毒血症、氣腫疽、黑疫、肉毒梭菌中毒症、破傷風等。這類疾病以發病急速、病程短促來不及治療而病死率高為特征。病原菌多為土壤性細菌，廣泛存在於世界各地，造成很大的經濟損失。梭菌性疾病的免疫，主要是通過滅活梭菌培養過程中所產的毒素而實現，毒素為疫苗的主要有效免疫抗原。因此，培養這類細菌，使它們大量生長繁殖並且分泌高效價的毒素、表達強毒力可以製作出免疫效果優良的疫苗。羊快疫（腐敗梭菌）、羔羊痢疾（產氣莢膜梭菌B型）、腸毒血症（產氣莢膜梭菌D型）三聯滅活疫苗就是其中一種，它可以預防羊的快疫、猝狙（產氣莢膜梭菌C型）、羔羊痢疾和腸毒血症四種傳染病，故稱為羊梭菌病三聯四防苗（簡稱羊三聯四防苗），這種疫苗在我國廣泛使用。

目前厭氣梭菌的培養，多使用厭氣肉肝胃酶消化湯，需要牛肉、肝、胃蛋白酶等昂貴的原料，成本高昂，工藝複雜。另一方麵，受到肉品質的影響（如抗生素的殘留、新鮮度等），使得培養基品質不穩定、質量不宜控製，進而影響到疫苗的品質。

本試驗旨在研製一種適合於厭氧菌生長繁殖並良好產毒的培養基，可應用於厭氧菌引起的疫苗製造、疾病診斷等研究領域。替代目前常用的、成本昂貴且需要複雜處理工序的動物源性材料的培養基。

1  材料和方法

1.1  主要試劑

蛋白腖分別為上海上食肉類有限公司生產的海豚牌蛋白腖（25kg袋裝,骨粉為原料製備）、上海東海製藥廠生產的生化試劑蛋白腖(500g瓶裝,魚類蛋白質水解物) 和細菌學F403蛋白腖(250g瓶裝，藥用帶魚粉為基質酶水解而成)；酵母浸出粉，上海冠生園添加劑製品有限公司生產；麥芽糊精，甘肅張掖龍源食品有限責任公司生產。

1.2  菌種

產氣莢膜梭菌B型（C58—2）、D型（C60—2），腐敗梭菌（C55—1）由中國獸醫藥品監察所提供。

1.3  培養基

自行設計，厭氧菌基礎培養基Ⅰ含蛋白腖、酵母浸出粉、糊精、葡萄糖、亞硫酸鈉、硫代乙醇酸鈉、無機鹽等,用NaOH調pH至8.0～8.5，116℃30min高壓滅菌即可；厭氧菌基礎培養基Ⅰ添加M等生長因子組成厭氧菌基礎培養基Ⅱ。肉肝胃酶消化湯培養基，按《中華人民共和國獸用生物製品規程》（以下簡稱《規程》）介紹的方法配製^[1]。

1.4  實驗動物

昆明（KM）小鼠，16—20g，由新疆天康畜牧生物技術股份有限公司生物製品事業部動物室自繁自養；新西蘭白兔，1.5—2.0kg，購於新疆地方病研究所動物中心。

1.5  試驗方法

1.5.1 細菌的培養  按《規程》方法將細菌接種於各種不同的試驗培養基中培養，經對比試驗優化培養基營養組分。

1.5.2  毒素或毒力測定  按《規程》方法進行。

1.5.3  疫苗配製與成品檢驗  按《規程》進行。快疫采用攻毒法效檢，猝狙、痢疾、腸毒血症采用免疫血清中和毒素法效檢。

2  結  果

2.1 設計的厭氧菌基礎培養基Ⅰ中，Zn²⁺、Mg²⁺離子對細菌生長和產毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ中（使用細菌學F403蛋白腖，含L-半胱氨酸鹽酸鹽），通過添加MgSO₄和ZnSO₄的比較試驗結果說明，產氣莢膜梭菌B型，在含Mg²⁺培養基中比含Zn²⁺培養基中的毒力略高。產氣莢膜梭菌D型在含Mg²⁺和含Zn²⁺培養基中其產生毒素的能力相同。腐敗梭菌在含Zn²⁺培養基中的毒力比含Mg²⁺培養基中的毒力要高，含Mg²⁺培養基沒有沒有達到《規程》規定的最小致死量標準。

表1  厭氧菌基礎培養基I中添加Zn²⁺、Mg²⁺離子對細菌產毒的影響

 

注：①攻毒劑量單位為ml;②表中分數表示注射後24h內的小鼠死亡數/注射數。以下同。

2.2  厭氧菌基礎培養基Ⅰ中L-半胱氨酸鹽酸鹽對細菌生長和產毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ中（使用細菌學F403蛋白腖、含Zn²⁺離子），通過L-半胱氨酸鹽酸鹽添加與否的比較試驗，觀察其對細菌產毒的影響，見表2.試驗結果說明，在培養基中L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加對各細菌產毒促進作用不明顯，兩組測毒結果相同。

表2 厭氧菌基礎培養基 I中添加 L一半胱氨酸鹽酸鹽對細菌產毒的影響

 

2.3  厭氧菌基礎培養基Ⅰ中不同品質蛋白腖對細菌生長和產毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ中（含Zn²⁺離子），通過使用不同品質的蛋白腖培養細菌後的產毒結果，見表3 ，可見使用生化試劑蛋白腖和細菌學F403蛋白腖培養基培養的各細菌產生的毒力相差不大，均可達到規程規定的相應標準，但與肉肝胃酶消化湯相比，略顯差異。使用海豚牌袋裝骨粉蛋白腖培養的細菌產生毒力較差，除產氣莢膜梭菌D型外，產氣莢膜梭菌B型和腐敗梭菌均未達到《規程》規定的毒力標準。

表3 厭氧菌基礎培養基 I中使用不同品質蛋白腖對細菌產毒的影響

 

 

2.4  厭氧菌基礎培養基Ⅰ中葡萄糖的添加量對細菌生長和產毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ中（含Zn²⁺離子，蛋白腖為生化試劑蛋白腖）葡萄糖的添加量對產氣莢膜梭菌D型、B型和腐敗梭菌的產毒影響不大，在添加0.2—1%範圍內，培養的細菌均能良好產毒，達到《規程》規定的毒力標準。結果見表4

表4 厭氧菌基礎培養基 I中葡萄糖的添加量對細菌產毒的影響

 

 

2.5  厭氧菌基礎培養基中添加生長刺激因子M等（厭氧菌基礎培養基Ⅱ）對細菌生長和產毒的影響

厭氧菌基礎培養基Ⅰ（含Zn²⁺離子，蛋白腖為袋裝海豚牌骨粉蛋白腖）中添加一種生長刺激因子M組成的培養基，我們稱其為厭氧菌基礎培養基Ⅱ。用此培養基無論是培養產氣莢膜梭菌D型、B型還是培養腐敗梭菌，它們產生的毒素或毒力，均達到《規程》規定的最高毒力標準。結果詳見表5。

表 5 厭氧菌基礎培養基 Ⅱ中細菌產毒結果

 

 

2.6 厭氧菌基礎培養基Ⅱ中糊精對產氣莢膜梭菌B型生長和產毒的影響

在厭氧菌基礎培養基Ⅱ中，糊精可以起到提高產氣莢膜梭菌B型產毒素的能力。在有糊精的情況下，無論是含葡萄糖0.3%還是0.5%的培養基，攻擊毒素劑量0.001ml，均2/2致死KM小鼠；無糊精的培養基，無論葡萄糖0.3%還是0.5%，攻擊毒素劑量0.001ml，隻1/2致死KM小鼠，低於前者水平。攻擊毒素劑量0.002ml時，培養基無論含與不含糊精，各組均2/2致死KM小鼠。見表6。

表 6 厭氧菌基礎培養基 Ⅱ中糊精對產氣莢膜梭菌 B型產毒的影響

 

2.7  厭氧菌基礎培養基培養細菌菌液配製的羊三聯四防苗檢驗結果

使用研製的厭氧菌基礎培養基培養的毒力達到《規程》規定的細菌菌液按配製3批疫苗，並進行檢驗，3批疫苗的無檢、安檢和效檢均達到《中華人民共和國獸用生物製品質量標準》^[2]的規定。見表7

表7 厭氧菌基礎培養基 I和培養基 Ⅱ培養細菌菌液配製的三聯四防苗檢驗結果

注： 血清中和試驗動物為K M小鼠， 攻毒試驗動物為家兔， 對照均2／2死亡； 腐敗梭菌 1 MLD為0.6 m L 。

3  討  論

由於厭氧菌自身缺乏有氧代謝必備的各種酶，如細胞色素和細胞色素氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶以及超氧化物歧化酶，造成自身代謝的缺陷，無法進行有氧代謝，而無氧酵解所產生的能量不足，所以厭氧菌在正常大氣環境下即不能生長又不能存活，要求的生長條件比較特殊。為使厭氧菌能正常生長，必須製備營養成分豐富，氧化還原電勢較低，具有特殊生長因子的專用培養基。通常用心、腦或其它髒器浸液配製厭氧菌培養基，並加入硫乙醇酸鈉、美藍、刃天青、氨基酸、葡萄糖、肝塊、肉渣、還原鐵、脫脂棉或少量活性炭等還原劑和除氧材料^[3]。《規程》中用於厭氧菌培養生產疫苗的培養基主要有厭氣肉肝湯、多蛋白腖牛心湯培養基、厭氣肉肝胃酶消化湯、魚肉胃酶消化湯肉肝湯、肉渣培養基等，培養基類型複雜，製造工藝煩瑣，成本高。

厭氧梭菌的類毒素具有很好的免疫原性，其疫苗的質量除與細菌本身的產毒能力（遺傳特性）有關外，還與培養方法和厭氧產毒培養基密切相關^[4]。產毒素強的培養基，製造出的疫苗效力就好，因此，我們可以用培養基產生毒素（毒力）的強弱作為選擇培養基的標準之一。

我們設計的厭氧菌基礎培養基分為三個係統，即厭氧係統（提供較低的氧化還原電勢）、營養係統（提供促進生長代謝的基礎物質，碳原、氮源、生長因子等）和輔助係統（即維持良好的厭氧環境，又提供營養成分）。厭氧係統采用添加還原劑亞硫酸鈉、硫乙醇酸鹽、葡萄糖（厭氧與營養雙重作用）等，使培養基保持較低的氧化還原電勢，以保證厭氧菌生長的良好環境；營養係統采用添加蛋白腖、酵母浸出粉和礦物質等，使培養基含有較豐富的腖、肽、氨基酸、維生素等營養成分，利於細菌生長繁殖和產毒；輔助係統采用添加糊精起到增加培養基的粘稠度，減少液體培養基中氧的溶解並可作為葡萄糖被利用後的後續碳源而被吸收利用的作用。所選原材料，均為成本較低的市售生物和化學試劑。經對產氣莢膜梭菌B型、D型和腐敗梭菌的培養試驗證明，產氣莢膜梭菌D型無論在培養基Ⅰ還是Ⅱ中，所有培養物所產毒素結果均達到規程規定的0.0005 ml致死KM小鼠的高標準，在疫苗的生產中采用廉價的厭氧菌基礎培養基Ⅰ，完全可以達到厭氣肉肝胃酶消化湯的培養標準，而原料成本僅為其21%。在篩選優化成分的厭氧菌基礎培養基Ⅰ中添加一種生長刺激因子（M）成為厭氧菌基礎培養基Ⅱ，對產氣莢膜梭菌B型和腐敗梭菌的培養效果也達到了《規程》規定的最高產毒標準，產氣莢膜梭菌B型毒素0.001 ml和腐敗梭菌菌液0.01 ml致死KM小鼠，原料成本也僅為厭氣肉肝胃酶消化湯的27%。

試驗中還發現，在我們設計的培養基中，Zn²⁺對腐敗梭菌的毒力表達具有促進作用，而Mg²⁺似乎對產氣莢膜梭菌B型的產毒效果較佳。厭氧菌培養中通常添加的可促進細菌生長繁殖的生長刺激因子L-半胱氨酸鹽酸鹽在我們的試驗中對細菌產毒沒有明顯效果。葡萄糖的添加量在0.2-1%範圍內對細菌產毒的增加影響不大。培養基中糊精的添加，對細菌的產毒有利。在厭氧菌基礎培養基Ⅱ中均使用袋裝骨粉蛋白腖，效果與生化試劑蛋白腖和細菌學F403蛋白腖相同，然而，價格卻相當於它們的1/20，在羊三聯四防苗的大生產中，降低成本產生的經濟效益十分顯著。

另外，我們還進行了培養基中活性炭的添加試驗，結果證明對促進產氣莢膜梭菌B型、D型和腐敗梭菌的生長繁殖和產毒沒有明顯效果。

實驗試製的三批疫苗經檢驗，均達到《中華人民共和國獸用生物製品質量標準》的標準，目前已在大生產中廣泛使用，效果進一步得到驗證。說明我們研製的厭氧菌培養基培養的產氣莢膜梭菌和腐敗梭菌所產毒素等抗原成分的免疫原性良好。

試驗證明，我們研製的厭氧菌基礎培養基Ⅱ可以作為產氣莢膜梭菌B、D型和腐敗梭菌通用的優良產毒培養基，成本僅略高於厭氧菌基礎培養基Ⅰ；對於產氣莢膜梭菌D型的培養，厭氧菌基礎培養基Ⅰ和厭氧菌基礎培養基Ⅱ沒有明顯差別，生產中完全可以使用厭氧菌基礎培養基Ⅰ。上述培養基成本低廉，產毒效果穩定，配製方法簡單（省去購肉、冷庫保存、剔選、絞碎、保溫消化、提清過濾等工序，市售生物化學試劑依次添加溶解即可），質量穩定可靠，還可節省人工，縮短生產周期。它們不僅可以應用於厭氧菌疫苗的生產，對於厭氧菌病的疾病診斷和研究都有重要的實際意義。

參考文獻

〔1〕 中華人民共和國農業部. 中華人民共和國獸用生物製品規程二OOO年版[S]. 北京：化學工業出版社.48-51.

〔2〕 中華人民共和國農業部. 中華人民共和國獸用生物製品質量標準二OO一年版[S]. 北京：中國農業科技出版社.33-34．

〔3〕 微生物培養基的製造與應用[M]。陳天壽主編，中國農業出版社. 5-6.

〔4〕 T Shimizu, A Okabe, J Mingani, et al. An upstream regulatory sequence stimulates expression of the perfingosin O gene of Clostridium perfringens[Ｊ]．Infection and immunity. 1991,59:137～142．

〔5〕 蔣玉文,王泰健,屠偉英，等. 羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、腸毒血症滅活疫苗複合培養基的研究[J].  中國獸藥雜誌，1994年（第28卷）第1期，3-8。

作者簡介  黃炯，男，1963年生，新疆畜牧科學院獸醫研究所傳染病室副主任，副研究員，從事預防獸醫學和生物製品學研究。郵編830000，電話4844134，傳真4844630，E-mail：huangjQxj.cninfo.net