(一)分離培養方法
UU在含95% 氮氣和5%CO2 環境中生長良好。其生長最適pH為5.5-6.5,最適溫度為36℃-37℃。UU具有尿素酶，能分解尿素產氨，使含酚紅指示劑的UU液體培養基pH值上升，顏色由黃色變為紅色。再將液體培養物轉種到UU固體培養基上，能生長成具特征性油煎蛋樣集落。
(1 )液體培養基：支原體肉湯培養基80mL，馬血清或小牛血清10mL，酵母浸液10mL,
10 %尿素溶液0.5mL-1.5mL, 0.4%酚紅溶液0.5mL,青黴素(使其在培養基中的濃度為500U/mL-2000U/mL,)用1N HCl 調pH值至5.5-6.5, 用小試管分裝後置冰箱中備用，每管1.5-2.0mL。
(2 ) 固體培養基：在100mL 支原體肉湯培養基中，加入瓊脂1.2-1.4g, ,高壓滅菌後冷卻到 50 ℃左右，逐一加入上述添加劑。搖勻，倒入無菌平皿中，待凝固後，置冰箱中備用。
接種標本後，經孵育，若培養基發生由黃變紅的顏色變化，透明無混濁(有別於某些細菌及 真菌生長)則可初步判斷為有支原體生長。大多數UU在24h內可獲得陽性結果。如果培養基發生顏色變化，但液體又有混濁，則應排除雜菌汙染, 可用0.45μm濾膜過濾後，作再接種觀察。進一步診斷需將液體培養物接種到固體培養基上培養, 經Dienes法染色後在低倍顯微鏡下觀察集落形態。陰性結果最好觀察５天。UU在固體培養基上集落核心呈粗顆粒狀,具極窄的邊，有時呈油煎蛋樣。如用 Dienes 法染色，集落為特異的藍色。一般細菌的菌落不著色，容易鑒別。
(二)代謝抑製試驗
根據特異性抗體能阻止支原體的生長和代謝這一特性，可用病人血清進行代謝抑製試驗。在加有抗血清的培養基中，支原體的代謝受到抑製，從而阻止了培養基的顏色改變。
代謝抑製試驗也可用於檢測感染支原體患者血清抗體的滴度。即將血清作10倍連續稀釋後，滴入支原體培養液，並以不加血清的支原體試驗管和不加支原體液的培養基管作對照。經37℃培養，不加抗血清的培養管支原體應生長良好，培養基變成紅色(UU或MH)，未加支原體液培養基管顏色不變。未發生顏色變化的最高血清稀釋度為代謝抑製試驗的抗體滴度。
(三) 間接血凝試驗
在一定條件下，抗體和相應抗原相遇，可形成抗原抗體複合物。這種複合物分子團很小,不能形成肉眼可見的反應。用經鞣酸處理的紅細胞作載體，將抗原吸附在其表麵，使紅細胞致敏，待與相應的血清抗體相遇時，可出現肉眼可見的凝集現象。
(四)生長抑製試驗
特異性抗體能阻止支原體的生長和代謝。用直徑為6mm-8mm的圓形滅菌濾紙片，以未稀釋抗血清浸透後放入無菌平皿內，於４℃下幹燥後待用。 吸取待檢菌液0.5mL塗布於固體培養基上，置37℃使瓊脂表麵稍幹燥。以無菌操作鑷取抗血清紙片放於瓊脂表麵,培養4日-5日後,在低倍顯微鏡下觀察濾紙片周圍有無支原體生長。若濾紙片周圍無菌落生長，出現抑菌圈大於2mm者表示該支原體與抗血清係同種免疫原，小於2mm判為異種。
(五)分子生物學診斷方法
目前主要應用聚合酶鏈反應(PCR)法及DNA探針技術作診斷。前者具有高度特異性和敏感性、且快速、簡便。但操作要求極為嚴格。
聚合酶鏈反應的原理是DNA片段擴增，其中支原體引物的選擇是PCR檢測技術中的關鍵。1９９1年Willonghby 設計的引物來自脲酶基因。Zheng等（1995）用MB抗原基因引物對所有14個血清型的UU均顯示良好的PCR擴增效果，其敏感性較Willonghby設計的脲酶基因引物更好
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