水中細菌總數的測定和大腸菌群的檢測（1）

（一)實驗目的

    (1)了解和學習水中細菌總數和大腸菌群的測定原理和測定意義。

    (2)學習和掌握用稀釋平板計數法測定水中細菌總數的方法。

    (3)學習和掌握水中大腸菌群的檢測方法。

（二)實驗原理

    水是微生物廣泛分布的天然環境。各種天然水中常含有一定數量的微生物。水中微生物的主要來源有：水中的水生性微生物(如光合藻類)、來自土壤徑流、降雨的外來菌群和來自下水道的汙染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來源於人和動物的傳染性排泄物。

    水的微生物學的檢驗，特別是腸道細菌的檢驗，在保證飲水安全和控製傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質狀況的重要指標。國家飲用水標準規定，飲用水中大腸菌群數每升中不超過3個，細菌總數每mL不超過100個。

    所謂細菌總數是指1mL或1g檢樣中所含細菌菌落的總數，所用的方法是稀釋平板計數法，由於計算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)數，故其單位應是cfu/g(mL)。它反映的是檢樣中活菌的數量。

    所謂大腸菌群，是指在37℃24h內能發酵乳糖產酸、產氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞杆菌的總稱，主要由腸杆菌科中四個屬內的細菌組成，即埃希氏杆菌屬、檸檬酸杆菌屬、克雷伯氏菌屬和腸杆菌屬。

    水的大腸菌群數是指100mL水檢樣內含有的大腸菌群實際數值，以大腸菌群最近似數(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽胞杆菌等多種細菌。這些細菌都可隨人畜排泄物進入水源，由於大腸菌群在腸道內數量最多，所以，水源中大腸菌群的數量，是直接反映水源被人畜排泄物汙染的一項重要指標。目前，國際上已公認大腸菌群的存在是糞便汙染的指標。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。

   水中大腸菌群的檢驗方法，常用多管發酵法和濾膜法。多管發酵法可運用於各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅適用於自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用於雜質較多、易於阻塞濾孔的水樣。

(三)實驗器材

(1) 菌落總數的測定：

1)培養基：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，無菌生理鹽水。

2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。

(2)大腸菌群的測定；

    1)培養基：

    ①乳糖膽鹽蛋白腖培養基：

    蛋白腖20g，豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。

    製法：將蛋白腖、膽鹽從乳糖溶於水中，校正pH，加入指示劑，分裝，每瓶50mL或每管5mL，，並倒置放入一個杜氏小管，l15℃滅菌15min。

    雙倍或三倍乳糖膽鹽蛋白腖培養基：除水以外，其餘成分加倍或取三倍用量。

    ②伊紅美藍瓊脂培養基：

    蛋白腖10g，乳糖10g， K₂HP0₄ 2g， 2％伊紅水溶液20Ml，0.65％美藍水溶液lOmL，瓊脂17g，水1000mL，pH7.1。

    製法：將蛋白腖、磷酸鹽和瓊脂溶於水中，校正pH後分裝．121℃滅菌15min備用。臨用時加入乳糖並熔化瓊脂，冷至50-55℃，加入伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。

    ③乳糖發酵管：

    除不加膽鹽外．其餘同乳糖膽鹽蛋白腖培養基。

    2)器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管等。

四）實驗方法

 (1)水樣的采集：

   1)自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min，以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。

    2)池水、河水、湖水等地麵水源水：在距岸邊5m處，取距水麵10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然後翻轉過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿後，將瓶塞蓋好，再從水中取出。如果不能在2h內檢測的，需放入冰箱中保存。

    (2)細菌總數的測定：

    1)水樣稀釋及培養：

    ①按無菌操作法，將水樣作10倍係列稀釋：

    ⑦根據對水樣汙染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度(飲用水如自來水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；汙染水—被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度)，吸取1mL稀釋液於滅菌平皿內，每個稀釋度作3個重複。

    ③將熔化後保溫度45℃的牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基倒平皿，每皿約15mL，並趁熱轉動平皿混合均勻。

    ④待瓊脂凝固後，將平皿倒置於37℃培養箱內培養24±1h後取出，計算平皿內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得1mL水樣中所含的細菌菌落總數。

    2)計算方法：

    作平板計數時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數後，求出同稀釋度的各平板平均菌落數。

 3)計數的報告：

 ①平板菌落數的選擇：

    選取菌落數在30-300之間的平板作為菌落總數測定標準。一個稀釋度使用兩個重複時，應選取兩個平板的平均數。如果一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板計數作為該稀釋度的菌數。若片狀菌落不到平板的一半，而其餘一半中菌落分布又很均勻，可計算半個平板後乘2以代表整個平板的菌落數。

    ②稀釋度的選擇：

a. 應選擇平均菌落數在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數報告之(表1例1)。

b．若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30-300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小於2，應報告其平均數；若比值大於2，則報告其中較小的數字(l例2、例3)。

c．若所有稀釋度的平均菌落均大於300，則應按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(l例4)。

d．若所有稀釋度的平均菌落數均小於30、則應按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(1例5)。

e. 若所有稀釋度均無菌落生長，則以小於1乘以最低稀釋倍數報告之（表1例6)。

    f. 若所有稀釋度的平均菌落數均不在30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落數乘以該稀釋倍數報告之(表l例7)。

    ③細菌總數的報告：

    細菌的菌落數在l00以內時，按其實有數報告；大於100時，用二位有效數字，在二位有效數字後麵的數字，以四舍五入方法修約。為了縮短數字後麵的0的個數，可用10的指數來表示，如表1“報告方式”一欄所示。

 

(3)大腸菌群的測定(多管發酵法)：

表 1 稀釋度的選擇及細菌數報告方式

 

 

稀釋度及菌落數			兩稀釋度之比	菌落總數/（cfu/g或cfu/mL）	報告方式（菌落總數）/（cfu/mL或cfu/g）
10-1	10-2	10-3
1	多不可計	164	20	-	16400	16000或1.6×104
2	多不可計	295	46	1.6	37750	38000或3.8×104
3	多不可計	271	60	2.2	27100	27000或2.7×104
4	多不可計	多不可計	313	-	313000	310000或3.1×105
5	27	11	5	-	270	270或
6	0	0	0	-	＜10	＜10
7	多不可計	305	12	-	30500	31000或3.1×104