高效脫酚菌的分離篩選

實驗目的：學習並掌握分離純化微生物的基本技能和篩選高效脫酚菌的實驗方法

實驗材料：

1．培養基

(1)      營養肉湯液體培養基。

(2)      營養肉湯瓊脂培養基。

(3)      脫酚菌分離培養基：蛋白腖0.5g，磷酸氫二鉀0.1g，硫酸鎂0.05g，蒸餾水 1000mL，調pH7.2~7.4，固體培養基添加1.3%瓊脂粉。

(4)      苯酚標準溶液：稱取分析純苯酚1.0g，溶於蒸餾水中，稀釋至1000mL，搖勻。此溶液每毫升含苯酚1mg。取此溶液10mL，移入另一100ml容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。用K₂CrO₄標準溶液對此溶液的酚濃度進行標定。

(5)      四硼酸鈉飽和溶液：稱取Na₂B₄O₇ 40g，溶於1L熱蒸餾水中，冷卻後使用，此溶液pH為10.1。

(6)      3% 4-氨基安替比林溶液：稱取分析純4-氨基安替比林3g，溶於蒸餾水，並稀釋至100mL，置於棕色瓶中，冰箱保存，可用兩周。

(7)      2％過硫酸胺溶液：取化學純過硫酸胺2g，溶於蒸餾水，並稀釋至100mL，冰箱保存，可用兩周。

2．儀器 恒溫振蕩器、恒溫培養箱、離心機、分光光度計。

3．其它 玻璃珠、錐形瓶、培養皿等

實驗原理：

環境中存在著各種各樣的微生物，其中某些微生物以有機汙染物作為其生長所需的能源、碳源或氮源，從而使有機汙染物得以降解。在工業廢水的生物處理中，對汙染成分單一的有毒廢水常可選育特定的高效菌種進行處理。這些高效菌具有處理效率高、耐受毒性強等優點。本實驗在以苯酚為唯一碳源的培養基中，經富集培養、分離純化、降解試驗等，可篩選出高效脫酚菌。

其中酚濃度的測定采用4-氨基安替比林法。其基本原理：4-氨基安替比林和酚類化合物在堿性溶液中和氧化劑鐵氰化鉀作用，生成紅色的安替比林染料，與標準管比色，可測出水樣中酚的含量。生成的色度在水中能穩定約30min，可在波長510nm處比色測定。本法最低檢出濃度為0.1mg/L。

實驗內容：

1．采樣 為了獲得酚分解能力較強的菌種，可在高濃度含酚廢水流經的場所采樣。如排放含酚廢水下水道的淤泥．沉渣等，在這些地方分得的微生物往往降解酚能力較強。

2．富集培養 將樣品置於裝有玻璃珠的50mL液體培養基並加有適量苯酚的三角瓶中，30℃震蕩培養。待菌生長後，用無菌移液管吸取1mL轉至另一個裝有50mL液體培養基並加適量苯酚的三角瓶中。如此連續2~3此，每次所加的苯酚量適當增加，最後可得脫酚菌占絕對優勢的混合培養物。

3．平板的分離和純化

（1）用無菌移液管吸取經富集培養的混合菌液0.lmL，注入9.9mL無菌水中，充分混勻，並繼續稀釋到適當濃度。

（2）取最後三個稀釋管，分別自各管中吸取稀釋菌液，滴一滴（約0.05mL）於固體平板（倒平板時添加適量的酚，最終酚濃度為50mg／L左右）中央，每個稀釋度做2~3個重複。

（3）用無菌玻璃刮棒把滴加在平板上的菌液推平，蓋好皿蓋。室溫放置，待接種菌液被培養基吸收後，倒置於30℃恒溫箱，培養1-2 d。

（4）挑選不同形態的菌落，在含適量酚的固體平板上劃線純化。平板倒置於30℃恒溫箱，培養1～2d。

4．轉接斜麵 將純化後的單菌落轉接至補加適量酚的試管斜麵，30℃恒溫箱培養24 h 。

5．降解試驗 用接種環取各斜麵菌苔一環，分別接種於100mL營養肉湯液體培養基中，振蕩培養至對數生長期（30℃，約16~24h），在培養物中加入少量濃酚液，使培養液內酚濃度達到10mg／L左右，進行酚分解酶的誘發；繼續振蕩培養2h後再次加入濃酚液，使培養液酚濃度提高到50mg／L左右，繼續振蕩培養4h。

6．測定含酚量

(1)      取經降解的培養液，10000r/min離心10min後，取上清100μL加入到10mL的試管中，加蒸餾水到5mL，加100uL0.5mol/L的氨水，50uL的2%的4-氨基安替比啉，混均，再加入50uL的8%的鐵氰化鉀溶液，混均，15min後，在510nm處測吸光度。

(2)      計算酚含量，井算出酚的去除率。

酚／(mg·L^-1)=從標準曲線上查得的酚（mg）×1000/V

式中V：取測定樣體積。

細菌脫酚率/%=（培養前酚濃度-培養後酚濃度）/培養前酚濃度*100%-酚揮發率（%）

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