革蘭陰性杆菌分科顯色培養基的效果評價

革蘭陰性杆菌分科顯色培養基的效果評價 

盧先雷  潘露   

[摘要] 

目的 為縮短G^-b的鑒定時間，提高報告速度，作者設計了一種集分離鑒定於一體的分科顯色培養基NBIIA（negative bacilli isolation and identification agar），評價該培養基對於革蘭陰性杆菌分離率和分科鑒定的準確性。

方法  檢測NBIIA對腸杆菌科、非發酵菌、弧菌科的菌共39株不同種屬的已知細菌的分科鑒定結果與金標準（OF+氧化酶）鑒定結果的一致率；采用（NBIIA+氧化酶）與（OF+氧化酶）對照，NBIIA與MC（麥康凱瓊脂）對照，對830份臨床標本（大便標本除外）進行檢測，統計分離率差異及陽性標本分科鑒定一致率。

結果  三科39株細菌分科鑒定一致率：腸杆菌科90%，非發酵菌100%，弧菌科80%； NBIIA與MC對830份標本G^-b的分離率各為19.9%、19.3%；二者一致率98.0%，（NBIIA+氧化酶）與（OF+氧化酶）對陽性標本中G^-b的分科鑒定一致率97.8% 。

結論  NBIIA的分離效果與傳統MC差異不具顯著性，但由於集分離鑒定於一體，可不必經過（OF+氧化酶）這一鑒定步驟,有助於革蘭陰性杆菌的快速鑒定。

    在引起人類感染的G^-b中，以腸杆菌科、非發酵菌、弧菌科細菌最為多見^[1-3]，但由於這三類細菌形態特征相似，而實際所包含的屬、種數量又最為龐大，故鑒定過程繁瑣，耗時長易出錯，影響了檢驗報告的速度，很不適應臨床的實際需要；而購置自動化儀器無論設備或試劑都較昂貴，使成本大大增加，因而抬高了收費價格，增加了病人負擔^[4]。為了解決這一矛盾，作者研製了一種集分離鑒定於一體的G^-b分科顯色培養基，可在18h內將細菌分離並鑒定至科，現介紹如下：

1．材料與方法：

1.1 材料：

1.1.1蛋白腖、牛肉膏、麥康凱瓊脂、氧化酶、微量生化管等購自杭州天和微生物試劑廠，示腖、水解酪蛋白購自英國OXOID公司，糖類、膽鹽、各種指示劑、NaCl等稍生物化學試劑為國產試劑。

1.1.2培養基：（1）麥康凱瓊脂（MC）：按規定用量配製，調整PH，121℃滅菌後，傾製平皿；（2）G^-b分科顯色培養基（NBIIA）：配方：營養瓊脂38g、葡萄糖10g、豬膽鹽4g、Na₂HPO₄ 6g、KH₂PO₄ 2g、H₂O 1L，加熱溶解，調整PH 7.0後加入專用指示劑1ml(可用1%溴甲酚紫1.6ml代替)，煮沸滅菌後傾製平皿（不需高壓滅菌）。

1.1. 3菌株:分別來源於衛生部臨檢中心；四川省臨檢中心（質控菌株）及臨床分離所得（經API複檢定種）：

1.1.3.1腸杆菌科（20株）：大腸埃希氏菌、弗氏枸櫞酸杆菌、遲緩愛德華菌、產氣腸杆菌、陰溝腸杆菌、聚團多源菌、蜂房哈夫尼亞菌、肺炎克雷伯氏菌、產酸克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌、摩根摩根菌、奇異變形杆菌、雷極普羅威登菌、傷寒沙門菌、粘質沙雷菌、普城沙雷菌、深紅沙雷菌、發光致病杆菌、小腸結腸炎耶爾森菌、弗氏耶爾森菌。

1.1.3.2非發酵菌（14株）：銅綠假單胞菌、施氏假單胞菌、產堿假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、惡臭假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、腐敗許諾旺菌、鮑曼不動杆菌、洛菲不動杆菌、糞產堿杆菌、腦膜炎敗血黃杆菌、產氣巴斯德菌、非液化莫拉菌、紫色色杆菌。

1.1.3.3弧菌科（5株）：副溶血弧菌、河弧菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、類誌賀鄰單胞菌。

1.1.4臨床標本：共830份：（1）來自我院住院和門診病人。標本類型有：痰、尿、膿、宮頸分泌物、精液、前列腺液、咽拭子、血（先增菌）、眼拭子、組織、膽汁、燒傷創麵分泌物、胸水（先增菌）、腹水（先增菌）、腦脊液（先增菌）等。（2）由於腸道菌群主要以腸杆菌科為主，弧菌、非發酵菌罕見，故而NBIIA對於大便標本的檢測意義不大，應加以排除。

1.2   方法：

1.2.1判斷方法與標準：

1.2.1.1NBIIA判斷方法：

腸杆菌科：黃色凸起菌落(某些菌屬在菌落聚集處呈藍色)，中心渾濁，直徑2.0mm-3.0mm（大）

    非發酵菌：蘭色扁平菌落(鮑曼不動杆菌在菌落聚集處由於色素堆積而呈橙黃色，單個菌落無色但不透明)，透明或半透明，直徑1.0mm-2.0mm（小）

               弧菌科：淡黃色扁平菌落，幹燥不透明，直徑1.5mm-2.5mm（大）

1.2.1.2OF+氧化酶判斷方法：

腸杆菌科：發酵（F），氧化酶（-）

               非發酵菌：氧化/不利用（O/-），氧化酶（+/-）

               弧菌科：發酵（F），氧化酶（+）

1.2.1.3氧化酶+NBIIA判斷方法：

腸杆菌科：黃色凸起大菌落，氧化酶（-）

               非發酵菌：蘭色扁平小菌落（鮑曼不動杆菌中等菌落），氧化酶（+/-）

               弧菌科：淡黃色幹燥大菌落，氧化酶（+）

1.2.2實驗室評價：

采用以上39株已知細菌對NBIIA進行測試，以OF+氧化酶試驗作為金標準，比較二者一致率，分別按科進行統計；

1.2.3臨床應用試驗評價：

1.2.3.1NBIIA與MC平行測試，比較二者對於G^-b的分離率差異；

1.2.3.2NBIIA+氧化酶與OF+氧化酶平行測試，比較二者對於G^-b的分科鑒定一致率。

2.結果：

2.1對39株已知細菌分科鑒定一致率：見表1；

      腸杆菌科一致率：90%，其中沙雷菌屬由於紅色素幹擾，以及生長較快而不易判斷；

非發酵菌一致率：100%，其中鮑曼不動杆菌為中等菌落，不透明，其餘各菌均為小菌落，透明；

弧菌科一致率：80%，其中氣單胞菌由於菌落較大，黃色較深，易判斷為腸杆菌。NBIIA與氧化酶聯用時可避免誤判；

三大科總體一致率：92.3%；

2.2臨床應用評價結果：

2.2.1NBIIA與MC對於830份標本分離率比較：見表2

NBIIA分離率：19.9%;MC分離率：19.3%;二者一致率：98.0%; kappa=0.94, P<0.01;

2.2.2NBIIA+氧化酶與OF+氧化酶對G^-B的分科鑒定的比較：

 二者一致率：161/165=97.8%;

表1  39株已知G^-b采用NBIIA與OF+氧化酶鑒定結果

                     表2  NBIIA與MC對830份標本分離率比較

3.討論：

對臨床常見的三大類G^-b的鑒定在以前很長一段時間都是采用傳統的雙歧表流程操作，雖然鑒定較準確，但繁瑣費時，報告時間長，很不適應臨床需要。國外從80年代開始推廣編碼法生化鑒定係統，於90年代引入我國^[5]，近十年來又有酶法生化鑒定係統及在編碼法生化鑒定基礎上發展起來的自動化儀器使鑒定速度大大加快。但即使如此也仍然跟不上臨床感染疾病的迫切需要。現在所采用的編碼係統在應用前均應先經分科鑒定，確定科級水平後才能應用相應的編碼體係，如此以來從分離培養到編碼鑒定之間36~48h的時間幾乎很難逾越^[6]，所以解決分科鑒定是縮短整個報告時間的關鍵所在。而作者根據腸杆菌、非發酵菌、弧菌對葡萄糖分解產酸能力強弱的不同、分解蛋白腖產堿相對產酸量的多少、及此三類細菌對膽鹽的耐受能力的大小所研製的這種分科顯色培養基集分離鑒定於一體，很好地解決了這一問題^[7-12]，且與傳統OF+氧化酶試驗有高度一致性。

在該培養基上，有很多細菌菌落形態具有十分獨特的特征，如肺炎克雷伯氏菌黃色偏白、黏液型特大菌落（３－５mm），臭鼻克雷伯氏菌為中等大小黃色膠水樣菌落，黏液型銅綠假單胞菌的菌落呈透明膠水樣，鮑曼不動杆菌在菌落幹燥、聚集處由於色素堆積而呈橙黃色，單個菌落無色不透明；陰溝腸杆菌則是天藍色微黃的大菌落。

   該培養基十分適合與快速酶法生化鑒定係統聯合應用，如此可將G^-b的培養、鑒定縮短至24h左右，大大緩解了臨床用藥與細菌學診斷之間的矛盾，促進了抗生素使用的規範化。且采用該培養基尚可節約一部分生化鑒定試劑，進一步促進醫療經費的節約，縮短病人治療周期，減輕感染病人病痛，具有一定的經濟效益和社會效益。

參考文獻

1         張財富.尿液細菌培養及藥敏結果分析.上海醫學檢驗雜誌,1999,3:153.

2         龐君容.呼吸道及泌尿道感染常見菌及其對抗生素的敏感性分析. 上海醫學檢驗雜誌,1997,3:147-148.

3         陳翠玲.兒童下呼吸道感染革蘭陰性杆菌的分離及耐藥分析.華中醫學雜誌,1997,1:47.

4         葉應嫵,馬紀平,李家宏等.我國微生物學檢驗50年進展.中華醫學檢驗雜誌，1999,5:261-263.

5         劉勇.數值鑒定法在腸杆菌科、弧菌科細菌鑒定中的應用.中國醫科大學學報,1997,2:187-189.

6   周惠平.臨床細菌學檢驗麵臨的挑戰. 中華醫學檢驗雜誌，1999,1:12-14.

7   張軍民,周貴民.臨床細菌檢驗快速方法應用進展. 中華醫學檢驗雜誌，1998,6:325-328.

8   Trepeta RW,EdbergSC. Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide based medium for rapid isolation and identification of Escherichia coli .J clin microbiol,1984,19:172-174.

9  MerlinoJ,SiarakasS,RobertsonGJ,et al.Evaluation of CHROMagar .Orientation for differentiation and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J clin microbiol,1996,34:1788-1793.

10  Rambach A .New plate medium for facilitated differentiation of salmonellae spp. From proteus spp and other bacteria. Appl Environ microbiol,1990,56:301-303.

11  DushH,AltiveggM. Comparison of Rambach agar ,SM-ID medium ,and Hektoen enteric agar for primary isolation of non-typhi salmonellae from stool samples .J clin microbiol ,1993,31:410-412.

12  InoueK,MikiK,TamuraK, et al .Evaluation of L-pyrrolidonyl peptidase paper strip test for differentiation of membera of the family Enterobacteriaeceae particularly salmonellae spp. J clin microbiol ,1996,34:1811-1812.

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