EHEC增菌培養基對O157：H7大腸杆菌增菌效果的觀察

觀察增菌培養基對 O157：H7 大腸杆菌的增菌效果。以實驗室常用方法測定目的菌及非目的菌在增菌培養基中生長的靈敏度及選擇性，比較幾種培養基對糞便標本中O157：H7的檢出率。實驗證明，N·m EHEC培養O157：H7大腸杆菌及非目的菌， 出現可見生長的最低接種濃度( cfu／m1)，前者明顯小於後者，呈現良好的選擇性，對糞便標本中O157：H7的檢出率 N·mEHEC明顯高於N·mEC。 N · mEC對O157：H7大腸杆菌具有良好的選擇性增菌作用，可著提高感染人群和汙染標本O157：H7菌的檢出率。

O157：H7是腸出血性大腸杆菌的常見血清型，給人類帶來的危害是眾所周知的，已引起醫療、衛生等部門的高度重視，衛生部下達的“腸出血性大腸杆菌O157：H7的監測方案”明確規定，O157：H7，感染腹瀉按《傳染病防治法》乙類傳染病進行報告和疫情處理。然而，病例的確診取決於病原學、血清學的檢 驗結果，直接分離，陽性率極低。到目前為止，國內尚無理想的專用培養基。檢索發現，大多采用EC肉湯加新生黴素進行培養，近來又有EHEC菌培養基推出 ，為了更有效地選擇增菌培養基，以提高O157：H7，大腸杆菌的檢出率，我們應用市售的mEC及 mEHEC 對O157：H7增菌效果進行了實驗比較，現報道如下 。 

1 材料

1.1菌株所試27株菌中，1-6號為O157：H7，大腸杆菌(均山梨醇一)，7-16號為普通大腸杆菌，1718號為變形杆菌，l 9-20號為克雷伯菌，21-22號為誌賀菌，2324號為沙門菌，25號為檸檬酸杆菌，26號為陰溝杆菌，27號為金黃色葡萄球菌，其中l、5、7、8、9、17、19號為標準菌株，所有菌株均由本站菌種室提供 。

1.2 主要試劑新生黴素為SIGMA公司生產，O157和H7，診斷血清由蘭州生物製品研究所和衛生部流研所生產。

1.3 mEHEC培養基：山東省衛生防疫站培養基室提供半成品( 加新生黴素後簡稱N-mEHEC)，按說明書製備應用。

1.4 mEC培養基：選用兩種，分別來自北京和上海兩家培養基廠家的半成品 (加新生黴素後分別簡稱 N- mECj和N- mECs ) 按說明書製備應用。

1.5 其他培養基：普通肉湯、營養瓊脂、麥康凱瓊脂( MAC)、山梨醇麥康凱瓊脂(SMAC)，均為山東省衛生防疫站培養基室生產的半成品，按說明書製備應用。

2 方法

2.1 增菌培養基的比較

2.1.1細菌生長的靈敏度比較

 ( 1 )分別取mECj、mECs及mEHEC培養基半成品，按使用說明配製，後加入相同劑量的新生黴素至培養基最終含量為20mg／L，無菌分裝每管備用。

( 2 )將試驗菌株37℃ 6h肉湯培養物以無菌生理鹽水做10倍係列稀釋，並以瓊脂平板法測定其濃度(cfu／ m1 )，取 10^-4—10^-85個稀釋度各lml×3，分別接種於3種增菌液各1支，37 ℃培養20h後，記錄呈現可見生長的最低接種濃度( cfu／m1 )。 

2.1.2 選擇性試驗

( 1 )分別將1號( O157：H7標準菌株)及8，10，13，16，17，19，26號菌株37 ℃ 6h肉湯培養物以無 菌生理鹽水做10倍係列稀釋，並以平板法測定細菌濃度( cfu／m1 )。取 1號菌10^-6稀釋度2ml ×7分別與 8， 10，13，l6，17，19號菌的10^-3稀釋度等量混合，與26號菌10^-4稀釋度等量混合，製成O157：H7菌與上述某一菌株的混合菌液。 

( 2 )取上述混合菌液 l ml ×3，分別接種於( 1 ) 所製備3種增菌培養基各1支，充分混勻，於培養前和培養後( 37 ℃2Dh )分別定量劃線於鑒別瓊脂平板(變形杆菌用MAC平板，其他6株菌用SMAC平板)，培養後計數兩種菌落。

2.2對糞便標本增菌效果的比較

 將健康人大便 2g乳化於20ml無菌生理鹽水中，並用瓊脂平板法測定含菌濃度( cf u／m1 ) 。取該懸液l m l ×12分別接種N· mEHEC、N·mECj、N·mECs各4支。將1菌37℃6h肉湯培養物以無菌生理鹽水做10倍係列稀釋，並用瓊脂平板法測定其濃度(cfu／m1 )，取10^-3 — 10^-6 4個稀釋度各 l ml ×3，分別接種含大便懸液的3種增菌培養基各1支，充分混勻，於培養前和培養後( 37℃ 20h ) 各取一菌環( d3mm)劃線於SMAC平板，培養後挑選無色菌落，用O157和H7診斷血清做玻片凝集。

3 結果

3.1 三種增菌培養基對細菌生長的靈敏度試驗：其中9，12，15，17，18，19，20，22，23，27號菌株，其最大接種濃度( 10⁴— 10⁵ cfu／m1 ) 均未見生長，其他菌株呈現可見生長的最低接種濃度見表 1 。

表 1 三種增菌培養基的比較

注： 表中數字 1m l 接種量呈現可見生長的最低濃度( cfu／m1 ) ，-表示最大接種濃度( 11號為 6×10⁴ ， 13號為9×10⁴ cfu／m 1 ) 仍未見生長 。 

3.2 三種增菌培養基對O157：H7大腸杆菌和非目的菌的選擇性試驗：增菌前所劃各平板生長的非目的菌菌落數為48 —204個，均未檢出O257：H7菌，增菌培養後，O157：H7與非目的菌在所劃平板上的菌落數見表2。 

表 2 三種增菌培養基選擇性增菌效果比較

注： * 增菌前 O 157：H7，大腸杆菌與非目的菌菌量之比；**表中分子為增菌後O157：H 7菌落數，分母為非目的菌菌落數。

3.3對糞便標本增菌效果比較：增菌前經SMAC瓊脂分離培養，3種增菌培養基對40份糞便標本O157：H7菌檢出率近似，隻在 1：90-200 ( O157：H7菌：大便細菌) 時檢出37.5％-40％，經37℃ 20h 增菌培養後，檢出結果見表3 。 

表 3 三種增菌培養基對 40份糞便模擬標本增菌效果比較

*大便懸液 1m1 ( 各糞便標本平板法計數為5.4×10⁶ —1.2 ×10⁷ cfu/ m1 ) 分別加入O157：H7菌液 6×104、 6×l0³、6×10²、60cfu／ml  各1ml。 

4 討 論

結果證明，對 O157：H7大腸杆菌增菌效果，依次為N· mEHEC、N.mECj 、N.mECs ；對非目的菌抑菌效果：所試葡萄球菌、變形杆菌、克雷伯菌，在3種培養基中均受到良好抑製，對所試檸檬酸杆菌， 陰溝杆菌均無明顯抑菌作用，對普通大腸杆菌，則表現了不同培養基對不同菌株抑菌效果的差異性(見表 1 ) ，以NmEHEC抑菌效果最佳。通過3種培養基對糞便模擬標本的對比檢測表明，增菌培養後，其O157： H7，大腸杆菌的檢出率，N· mEHEC明顯高於兩種N mEC(見表3 ) ，而培養前3種培養基隻在l：90—200 (O157：H7，菌：大便中非目的菌) 時檢出率分別為37.5％、37.5％、40％，三者無顯著差異。

進一步檢測發現，當3種培養基不加新生黴素時，所試O157：H7，菌株呈現可見生長的最低接種濃度近似，對非目的菌的抑菌效果，除葡萄球菌均被抑製外，隻有N．mEHEC對11號、13號大腸杆菌和變形杆菌有不同程度的抑菌作用。當加入新黴素至20 mg／L時，三種培養基除有效地抑製大部分非 目的菌外，對O157：H7，菌的增菌效果出現明顯差異( 見表 1 ) ，以NmEHEC增菌效果最佳。

我們在EC肉湯中不加膽鹽，隻加相同劑量的新生黴素 ( 20mg／L )，則O157：H7菌均受到不同程度的抑製。當膽鹽量為1.5g／L時，所試 Ol57：H7菌株生長情況與N · mECs近似；膽鹽量增至5g／L時， 與 N·mECj近似；膽鹽含量加至8 g／L時，與 N·mEHEC結果近似。由此可見，在一定範圍內，適當增加膽鹽用量，不僅可有效抑製部分非目的菌的生長，也可減弱或消除新生黴素對 O157：H7的抑菌作用，從而加強對目的菌的增菌效果 。

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