獼猴桃細菌性潰瘍病菌檢疫技術操作辦法
1 主題內容及應檢範圍
1.1 本辦法規定了獼猴桃細菌性潰瘍病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae Takikawa et al. 的檢疫檢驗及檢疫處理操作辦法。
1.2 本辦法適用於林業植物檢疫機構對獼猴桃屬Actinidia spp.植物活體、殘體的檢疫檢驗和檢疫處理。
2 產地檢疫
2.1 種苗繁育基地的建立
2.1.1 培育的獼猴桃，應從無病區采集接穗，或用無病蟲的當年生半木質枝條作插條。
2.1.2 加強晚秋水、肥管理，避免在強風和冬季低溫的高海拔區，即易發生霜凍的地方建園。
2.2 踏查
2.2.1 在種苗繁育基地、獼猴桃栽植地的果園、林場，以自然界線、道路等為單位進行線路（目測）踏查。
2.2.2 調查寄主的主幹及分枝上部是否有淡黃色或黃褐色病斑；病斑處是否有小孔，從中向外流出白色或鐵鏽色液體，病部下方形成深褐色汙斑。
2.2.3 調查枝條上是否有暗綠色或暗褐色水漬狀縱向、線形龜裂；新梢是否呈暗褐色萎蔫枯死，病部浸出白色水漬狀液體。
2.2.4 調查葉片上是否有紅色小點，或大小為2–3 mm的褐色多角形病斑，周圍有明顯黃色水漬狀暈圈，葉片向裏或向外翻卷。
2.2.5 確認有疫情需進一步掌握危害情況的，需設標準地（或樣方）做詳細調查。
2.3 標準地（或樣方）調查
2.3.1 種苗繁育基地樣方設置與調查
2.3.1.1 樣方的累積麵積應不少於調查總麵積的5%。
2.3.1.2 每塊樣方麵積為0.1 hm2，采取棋盤式取樣法，抽取樣樹5–10株，進行病害分級調查。
2.3.2. 果園標準地設置與調查
2.3.2.1 按果園麵積設置，10 hm2以下（含10 hm2）設1塊，每增加5 hm2增設1塊。
2.3.2.2 每塊標準地麵積為0.1 hm2，采取棋盤式取樣法，抽取樣樹10株，進行病害分級調查。
2.4 病害分級標準
單株病害分級標準
Ⅰ級 全株葉、蔓無病 代表值0；
Ⅱ級 1–20片葉和1個側蔓發病，或1/3以下的新梢發病 代表值1；
Ⅲ級 21–30片葉和2–3個側蔓發病，或1/3–1/2的新梢發病 代表值2；
Ⅳ級 31片以上葉和1–2個主蔓發病，或1/2以上新梢發病 代表值3；
Ⅴ級 主幹發病1/3，或多數側蔓發病、植株部分枯死 代表值4；
Ⅵ級 主幹發病1/3，或全部主蔓枯死發病、全株枯死 代表值5。
果園病害分級標準（以被害株率為標準）
輕 被害株率 10%以下；
中 被害株率 11%–30%；
重 被害株率 31%以上。
2.5 所采集的感病材料應包含植物的所有部分和各種症狀部分。應盡可能采集感病初期的病株部分，以利於病原細菌的分離。
2.6 樣品置於聚乙烯袋內或其它合適容器內保鮮和防止汙染。樣品應冷藏存放，避免受到陽光的照射。
3 調運檢疫
3.1 抽樣比例
3.1.1 苗木100株以內（含100株）的應全部檢查；100–1000株按10 %抽取；1000株以上按一批貨物總件數（株）的5 %抽取。
3.1.2 植株及植株殘體應全部進行檢查。
3.2 抽樣方法
3.2.1 苗木按照抽樣比例，采取分層方式設5個樣點進行抽樣。
3.2.2 對攜帶有病症的植株及植株殘體應全部進行檢查。
3.3 現場檢驗
3.3.1 檢查寄主的葉片是否向裏或向外翻卷，並有紅色小點或多角形病斑，周圍有明顯黃色水漬狀暈圈。
3.3.2 檢查1–2 a枝條上是否有水漬狀縱向、線形龜裂，新梢是否萎蔫枯死，並有白色水漬狀液體溢出。
3.3.3 檢查寄主幹部是否在病斑下方呈深褐色並有鐵鏽色液體溢出。
4 檢疫檢驗
4.1 溢菌檢驗 在具典型症狀的病部上，取病健交界處的一小塊病組織，在顯微鏡下切片檢查是否有大量細菌液溢出。
4.2 分離培養檢驗
4.2.1 取小塊病斑組織，經表麵消毒，滅菌水洗3次後，研碎靜置10 min，采用假單孢屬選擇性培養基進行分離，將分離並經純化後的細菌移植到BPA培養基斜麵上培養48 h，置8 ℃冰箱保存。分離鑒定方法見附錄1。
4.2.2 檢查在BPA培養基平板上是否形成汙白色、圓形、全緣、凸起、光滑、直徑約為1–3 mm的菌落；在KBA培養基上未見熒光；在Luisetti培養基上發生藍色熒光及在SPA培養基上呈粘液狀菌落。
4.3 染色檢驗
4.3.1 鞭毛染色 采用西薩—基爾染色法。經染媒5–7 min→水洗幹燥→苯酚品紅染色5 min→水洗幹燥後鏡檢。
顯微鏡下菌體和鞭毛為陰性反應，呈紅色，極生1–3根。
4.3.2 革蘭氏染色 采用結晶紫草酸胺染色法。經固定塗片→染色1 min→水洗數秒吸幹→碘液處理1 min→水洗數秒吸幹→褪色30 s→水洗數秒吸幹→複染10 min→水洗吸幹後鏡檢。
顯微鏡下菌體為革蘭氏陰性反應，呈紅色。
4.4 生理生化檢驗
4.4.1 生長與溫度試驗 菌株生長最高溫度為35 ℃；最適生長溫度為25–28 ℃；致死溫度為55 ℃條件下10 min。
4.4.2 精氨酸雙水解酶檢驗 配製Thornley培養基。每試管裝3–4 ml培養基滅菌®冷卻®針刺接種細菌至培養基底部®立即用滅菌凡士林封管→在27℃條件下培養7 d。
在此條件下，精氨酸雙水解酶為陰性，顏色不變。
4.4.3 果聚糖（Levan）試驗 用細菌懸浮液，在SPA培養基上，或用葡萄糖代替蔗糖培養基平板上分別劃線。在25℃條件下培養3–7 d，形成白色、粘稠、圓頂、隆起而有閃光的菌落為陽性反應。
在此條件下，在SPA培養基上可形成前述菌落，果聚糖試驗為陽性；而在用葡萄糖代替蔗糖培養基上，不形成前述菌落。
4.4.4 冰核活性測定 用直徑16 mm的螺口試管，裝濃度大於168 CFU/ml細菌液3–5 ml，加蓋置於–4℃水浴中（水浴含11.2%的食鹽水）。如此液在5 min內結冰，表明有冰核活性。
在上述條件下，菌液經測定為無冰核活性。
4.5 碳素化合物的利用和分解
4.5.1 碳素化合物產酸試驗 配製Ayers培養基。在適溫下放置4–5 d後，每5 ml培養液接種0.1 ml含108 CFU/ml 的菌懸浮液，適溫下培養3–4周，產酸時培養液變為黃色。
在此條件下，培養液變為黃色，能利用葡萄糖、棉子糖、山梨糖、蔗糖產酸。
4.5.2 V. P試驗（產生3–羥基丁酮試驗） 將細菌接種於甲基紅試驗用培養液，培養2–4 d，按每毫升加40% KOH（含0.3% 肌酸或肌酐）0.1 ml溶液，置48–50℃水浴中，充分搖動2 h，在4 h內觀察出現紅色為陽性反應。
在此條件下，培養液測驗為陰性反應，不呈紅色。
4.5.3 甲基紅試驗（MR試驗） 將細菌接種於葡萄糖蛋白腖培養液，適溫下培養2–4 d以上，取培養液5 ml，加甲基紅試劑2–3滴。培養液變紅色為陽性反應，黃色為陰性反應。
在此條件下，培養液測驗為陰性反應，呈黃色。
4.6 氮素化合物的分解
4.6.1 硝酸鹽還原試驗 將硝酸鹽半固體培養基用4% NaoH調節pH至7.0–7.2。每支試管分裝5–10 ml培養基滅菌，針刺接種細菌。試管培養3、5、7 d後，分別用Griess–Liosvary試劑測定法測定亞硝酸。如呈紅色，表示有亞硝酸根為陽性反應。
在此條件下，培養液測驗為陰性反應，不呈紅色。
4.6.2 吲哚試驗
4.6.2.1 配製胰蛋白腖10.0 g、酵母膏5.0 g 、蒸餾水1000.0 ml的培養液，接菌後適溫培養。
4.6.2.2 將濾紙剪成小條，在飽和草酸溶液中浸過後取出，滅菌烘幹後，夾在棉花塞和管壁之間，使濾紙懸掛在不接觸培養液的液麵上，有吲哚產生的濾紙變淡紅色。
在此條件下，濾紙不變淡紅色，不產生吲哚。
4.7 大分子化合物的分解
4.7.1 明膠液化 在BPA培養基中加10%–12%的明膠，每支試管4–10 ml，在121℃滅菌12–15 min，冷卻後用穿刺法接菌，在適溫中培養3、7、14和21 d，將試管取出置冷水和4℃冰箱中，使明膠凝固，檢查明膠是否凝固或液化，並以未接菌的明膠作對照。
在此條件下，該菌株不能使明膠液化。
4.7.2 石蕊牛乳反應 用石蕊牛乳培養液，間歇滅菌3次，每次通蒸氣20–30 ml。接種後於28℃條件下培養，以不接種的石蕊牛乳作對照，定期觀察4–6周。
在此條件下，石蕊牛乳反應變藍，示有微堿性。
4.7.3 吐溫80的水解 采用Sierra方法測定。將吐溫80高壓蒸氣滅菌後，取10 ml加入蛋白腖10 g、CaCI·2H2O 0.1 g、瓊脂17 g、蒸餾水1000 ml，pH 7.4的培養基中，混勻後製成平板，點種細菌，適溫培養7 d。如在菌落周圍有不透明白色沉澱區出現，表示吐溫80被水解，為陽性反應。
在此條件下，吐溫80能水解，為陽性反應。
4.8 其它生理生化試驗
4.8.1 氧化酶試驗 在培養皿內放一張濾紙，濾紙上加3–4滴1%二甲基對苯二胺鹽酸鹽，使其濕潤。用玻棒挑取生長24 h的菌苔塗在濾紙上，若菌苔在10 s內變成紫色，為陽性反應；在60 s以後變色或一直不變色，為陰性反應。
在此條件下，菌苔的氧化酶試驗為陰性反應。
4.8.2 過氧化氫酶（接觸酶）試驗 挑取在固體培養基上生長24–48 h的菌苔，置於幹淨玻片上，滴加3%的過氧化氫，30 s內有大量氣泡產生為陽性，不產氣泡為陰性。
在此條件下，菌苔過氧化氫酶試驗為陽性。
4.9 致病性測定
4.9.1 煙草過敏性反應
將在26℃條件下，培養72 d的菌株，用無菌水配成3×108 /ml的菌液，對煙草下表皮進行皮下接種，在24 ℃條件下經20–24 h後檢查是否出現過敏性壞死斑。
4.9.2 植株致病性測定
將分離菌株接種在植株健葉或休眠枝條上，菌液濃度6×108 /ml。10–15 d後或次年2月下旬到3月下旬，檢查是否出現典型葉斑症狀，具暈圈；休眠枝條有潰瘍症狀及菌濃。
根據上述檢驗結果，對照病原特征，鑒定是否為獼猴桃潰瘍病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae Takikawa et al.
5 除害處理
5.1 禁止從疫情發生區調運染疫植物活體。
5.2 發現帶疫植株應噴灑1萬單位農用鏈黴素3000倍液、30%琥珀酸銅（DT）膠懸劑200倍液或70% 百菌通 500倍液分2–3次進行處理。
上一篇：獼猴桃細菌性潰瘍病菌
下一篇：獼猴桃細菌性潰瘍病菌的分離鑒定方法
