獼猴桃細菌性潰瘍病菌的分離鑒定方法

獼猴桃細菌性潰瘍病菌的分離鑒定方法

1、病原鑒定

根據葉片上的水漬狀暈圈和枝幹上白色水滴狀菌膿初步診斷為細菌性病害。取病健交界處組織一塊，放於載玻片上，向小塊上滴1–2滴無菌水或蒸餾水，加蓋玻片後。立即用低倍顯微鏡觀察水滴與組織交界處，見到雲霧狀菌溢，亦可證明組織內有細菌存在。

2、病原分離

新鮮病健交界處的病組織洗淨後切成4 mm×4 mm小塊，用滅菌水衝洗3次；分別用70％酒精和0.5％–1％的次氯酸鈉進行表麵消毒，病組織在消毒液中浸泡1–2 min，再用無菌水衝洗3次，按下列方法進行分離。

培養皿稀釋分離法：取滅菌後的培養皿3–4個，每皿加滅菌水0.5 m1，將經表麵消毒並充分衝洗的病組織小塊移至第一皿的水滴中，用滅菌玻璃棒碾碎，靜置30分鍾左右，是組織內細菌流入水中，配成懸浮液。用滅菌後的接種環從第一皿內移植2–3環至第二皿內並充分、混合後再移植到第三皿，依次稀釋到最後一皿。將熔化的瓊脂培養基冷卻至45 ℃左右，倒入每個皿中，在培養基未凝固前，輕轉動培養皿，使培養基與菌懸液混勻，冷卻後將培養皿翻轉，置25–30 ℃下培養。

平板劃線培養法：將上述的病組織放在滅菌載玻片上的一滴滅菌水中，玻棒攪碎，靜置一段時間，用滅菌的接種環在普通培養基或選擇性培養基上劃線培養。

培養基可選用：

肉汁腖瓊脂培養基（BPA）：

        牛肉浸膏                3.0 g

        蛋白腖                  5–10 g

        蔗糖                    10.0 g

        酵母膏                  1.0 g

        瓊脂                    17.0 g

        蒸餾水                  1000 ml

        pH                      7.0

培養性狀：菌落圓形，汙白色，全緣，微凹，光滑，生長緩慢，直徑約1–3 mm。

蔗糖蛋白腖培養基（SPA）：

        蔗糖                    3.0 g

        蛋白腖                  5.0 g

        K₂HPO₄                   0.5 g

        MgSO₄•7H₂O               0.25 g

        瓊脂                    17.0 g

        蒸餾水                  1000 ml

        pH                      7.2–7.4

培養性狀：菌落呈粘稠狀。

金氏B培養基（KBA）：

        甘油                            10.0 g

        膘蛋白腖（proteose peptone）      20.0 g

        K₂HPO₄                           1.5 g

        MgSO₄•7H₂O                       1.5 g

        瓊脂（水洗）                    17.0 g

        蒸餾水                          1000 ml

        pH                              7.2

培養性狀：有黃綠色熒光。

3、致病性測定

應選擇未成熟的及正在迅速生長的植物的新梢、新葉進行；盡可能模擬自然侵染方式接種寄主。

將培養24–72 h的單胞菌落製成菌懸液，濃度為3×10⁸ CFU/ml，進一步稀釋到10⁴–10⁷ CFU/ml，用針刺法或塗抺傷口法對獼猴桃離體枝葉或幼苗、新枝等進行接種，溫度為15 ℃左右，保濕48 h，7–10 d後觀察，如表現明顯症狀，證明所分離的單胞菌落為植物寄生細菌，可進一步做細菌學和生理生化性狀的觀察試驗，以鑒定細菌的種類。

如分離所得菌株過多，可采取煙草過敏反應（HR）以快速測定分離物的致病性。方法是配製10⁷–10⁸ CFU/ml的菌懸液，用注射針將菌液從煙草下表皮注入葉肉組織間。煙草植株應保持在25 ℃，相對濕度85%，日照16 h條件下，在24–48 h表現枯斑的為陽性反應，3 d後出現黃斑的為陰性反應。

HR測定是LOPAT試驗的測定項目之一，對於熒光假單胞菌的鑒定很有意義。獼猴桃細菌性潰瘍病的HR為陽性。

4、形態特征觀察

細菌的形態和大小的觀察：用接種環從固體培養基表麵挑取少量細菌和蒸餾水混合，配成細菌懸浮液，取一滴懸浮液均勻地塗於幹淨的載玻片上，任其自然幹燥，通過火焰2–3次固定後染色，所用菌種齡應在24–48 h，可用苯酚品紅染色法染色。

革蘭氏染色的菌體通常也可同時進行細菌菌體形態、大小及排列情況的觀察。

革蘭氏染色法：獼猴桃細菌性潰瘍病菌為革蘭氏陰性。可用結晶紫草酸銨染色法進行。另外，用KOH溶解試驗可作為輔助試驗，快速確定細菌的革蘭氏屬性。方法如下：取1–2滴3 % KOH溶液置於幹淨載玻片上，用接種環或牙簽將培養24–48 h的單個或少許幾個菌落移到KOH液滴中，攪動5–15 s後，用接種環或牙簽將菌液向上提取，觀察提取時有無粘絲現象出現。凡是革蘭氏陰性菌提取時都有清楚的粘絲相連，且KOH液滴變稠。

鞭毛染色觀察：可用西薩–基爾染色方法。

獼猴桃細菌性潰瘍病菌為極生單鞭毛，少有2–3根。

莢膜染色法：獼猴桃細菌性潰瘍病菌無莢膜。

芽孢染色法：獼猴桃細菌性潰瘍病菌無芽孢。

經過以上症狀觀察、病原菌分離、培養性觀察、致病性測定及形態特征觀察、即可基本完成病原菌的鑒定。

獼猴桃細菌性潰瘍病菌Pseudomonas  syringae  pv. actinidiae的主要特征

菌體短杆狀，大小為（1.4–2.3）μm×（0.4–0.5）μm，革蘭氏染色陰性，無莢膜，不產芽孢；鞭毛單極生1–3根。

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