魚類嗜水氣單胞菌滅活疫苗製作規程(1)

魚類嗜水氣單胞菌滅活疫苗製作規程 

前   言

 　　為規範魚類嗜水氣單胞菌滅活疫苗製作要求，保證疫苗質量，特製定本標準。

本標準的附錄A、附錄B為規範性附錄。

1　範圍

　　本標準規定了魚類嗜水氣單胞菌滅活疫苗(以下簡稱“疫苗”)製作的術語和定義、技術要求、生產工藝流程、菌種生產、操作規程、發酵生產操作規程、安全性檢測、效力檢驗、產品分裝與保存、留樣待檢。

　　本標準適用於我省魚類嗜水氣單胞菌滅活疫苗的生產。

2　規範性引用文件

　　下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨後所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用於本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用於本標準。

　　GB 6388 運輸包裝收發貨標誌

3　術語與定義

　　下列術語與定義適用於本標準。

　　嗜水氣單胞菌滅活疫苗

　　嗜水氣單胞菌培養液加入適量的福爾馬林溶液，在一定的恒溫條件下經適當時間滅活後製成的全菌液。

4　技術要求

　　按附錄A的要求執行。

5　生產工藝流程

   原菌種活化 → 菌種擴大培養 →  種子罐培養  →   發酵罐培養  →  滅活 →　安全性檢測 →  效力檢測 →  產品分裝。

6　菌種生產操作規程

6.1　儀器設備和試劑

　　無菌室或超淨工作台、滅菌鍋、三角瓶、試管、冰箱、恒溫培養箱、顯微鏡、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、牛肉膏、蛋白腖和瓊脂等。

6.2　培養基製備

　　按如下配方製備培養基：取牛肉膏0.6%、蛋白腖1%、氯化鈉0.5%、瓊脂2%，將瓊脂加熱溶化後用0.1mol/L氫氧化鈉或鹽酸調節pH值為7.0～7.5，然後分裝三角瓶或試管，置於滅菌鍋內，在0.11MPa壓力下滅菌30min，冷卻後製成斜麵備用。

6.3　菌種活化與擴大培養

6.3.1　菌種來源

　　菌種來源為經係統鑒定的致病性嗜水氣單胞菌。

6.3.2　活化與擴大培養

　　在無菌條件下從嗜水氣單胞菌原菌種斜麵上挑取少量菌苔，置放試管斜麵內進行劃線，然後置28℃溫箱內培養（22～28）h，經檢查無雜菌，菌體生長整齊後，從試管斜麵挑取菌苔再次重新接種，在28℃溫箱內培養（22～28）h，用肉眼觀察，如菌苔豐滿，無雜菌，則放4℃冰箱中備用。否則重作。

7　發酵生產操作規程

7.1　儀器設備和藥品

　　種子罐、發酵罐、顯微鏡、麥氏比濁管、試管、載玻片、三角瓶、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、牛肉膏、蛋白腖、生理鹽水等。

7.2　種子罐培養

7.2.1　培養基

　　按如下配方製備培養基：取牛肉膏0.6%，蛋白腖1%，氯化鈉0.5%。混溶後調pH值為7.0～7.5。

7.2.2　空罐滅菌

　　將空發酵罐清洗幹淨，在0.11MPa壓力下滅菌30min。

7.2.3　裝料

　　將7.2.1條配方的培養基灌裝，投料量不得超過罐容積的70%。

7.2.4　滅菌

   裝好料後，在0.11MPa壓力下滅菌30min。

7.2.5　接種

　　發酵罐滅菌後冷卻致28℃即可接種。在無菌條件下將每個三角瓶斜麵菌種加（100～500）ml無菌水，把菌苔刮下製成菌懸浮液，含菌量為10CFU/ml。將製好的菌懸浮液，在無菌條件下，按1%的比例接種於冷卻至28℃的種子罐內進行培養。

7.2.6　培養條件的控製

　　接種後在溫度為28℃，壓力為0.05MPa，通氣量1∶1（每分鍾進出空氣體積比）和220r/min攪拌條件下，培養（22～28）h。

7.2.7　培養過程中的檢測

7.2.7.1　指標

　　接種後22h開始，每隔2h取樣一次檢測，包括菌體生長狀況、含菌量和pH值，達到如下指標，即可移種至發酵罐內發酵培養。

　　a）菌體生長整齊；

　　b）處於對數生長期；

　　c）含菌量10×10⁸ CFU /ml以上；

　　d）無雜菌汙染；

　　e）pH值為7.0～7.5。

7.2.7.2　檢測方法

　　a）在無菌條件下，取培養液（50～100）ml，於滅菌三角瓶中，備用；

b）用無菌吸管或接種環取發酵液一滴，置於潔淨載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌體生長狀況，判定是否有雜菌生長；

　　c）含菌量檢測　細菌計數采用傾注平板法或用麥氏比濁管估測，麥氏比濁管細菌計數按附錄B的方法執行。

7.3　發酵罐培養

7.3.1　培養基配製、滅菌和裝料方法同7.2條。

7.3.2　接種

　　在無菌條件下將種子罐的細菌培養液，按1%的比例接種於冷卻至28℃的發酵罐內進行培養。

7.3.3　發酵罐培養條件的控製

　　同7.2.6條。

7.3.4　培養過程中的檢測

　　接種後22h開始，每隔2h取樣一次檢測，包括菌體生長狀況、含菌量等，當含菌量達到1.0×10⁹ CFU /ml以上（根據生產需要確定菌液濃度），即可對發酵罐內菌液進行滅活。

7.3.5　檢測指標與方法

　　同7.2.7條。

7.4　滅活

7.4.1　滅活方法

　　將發酵罐內細菌培養液加入福爾馬林，使福爾馬林最終濃度為0.15%，在4℃條件下滅活48h或25℃條件下滅活24h。在滅活過程中，每天充分攪拌（2～3）次。滅活後的菌液即為魚類嗜水氣單胞菌滅活疫苗。

7.4.2　無活菌檢驗

　　在無菌條件下，取10ml滅活後的疫苗，用生理鹽水將待檢疫苗稀釋10倍，吸取0.2ml分別接種到肉湯蛋白腖液體培養基、厭氣肉肝湯培養基上各一管，在37℃條件下培養48h，均應無菌生長。如有菌體生長，則為滅活不徹底，為不合格產品。

8　安全性檢測

8.1　試驗容器

8.1.1　選用容積為（1～2）m³的水泥池或水簇箱等容器。容器需配有控溫和通氣增氧裝置。

8.1.2　容器在使用前用萬分之一的漂白粉水溶液消毒24 h，消毒後用自來水衝洗幹淨，並放入適量經活性碳處理的自來水曝氣24h後待用。

8.2　試驗魚種

選用體重為100g左右，體質健壯，遊動活潑，無任何損傷和疾病的鯽魚，在試驗前用2%的食鹽水浸浴（5～10）min, 將魚種放入符合8.1條規定的容器中，於（28～30）℃水溫下飼養，觀察15d，所有魚均應活動正常。如發現有魚種出現有細菌性敗血症症狀，則該批魚種不得使用。

8.3　安全性試驗

取符合8.2條規定的鯽魚60尾，設實驗組和對照組，各30尾魚。將疫苗用無菌注射器對實驗組魚種作胸腔注射，注射劑量為0.5 ml /尾（疫苗濃度1.0 X10⁹ CFU / ml）。對照組注射等量生理鹽水。將魚種在（25～28）℃水體中飼養，觀察15d，如發現實驗組魚患細菌性敗血症，而對照組魚為陰性，則該批疫苗為不合格產品。

9　效力檢驗

9.1　魚種免疫

9.1.1　按8.1條規定準備試驗容器，按8.2條規定選擇試驗魚種。

9.1.2　將符合安全試驗的待檢樣品用無菌生理鹽水稀釋成含菌量為1.0 X10⁹ CFU / ml，用無菌注射器對魚種進行免疫注射，每尾腹腔注射劑量為0.3ml，試驗魚種不少於30尾。第三天再用同劑量疫苗強化免疫，注射後的魚種在（25～28）℃的水溫下飼養30d,該批魚種即為免疫魚種。

9.2　免疫魚攻毒

在無菌條件下將試管斜麵嗜水氣單胞菌苔刮下製成菌懸浮液，含菌量為1.0 X10⁸ CFU /ml。以0.3m L/尾的劑量，分別注射經免疫的試驗組魚種和未經免疫的對照組魚種（試驗組和對照組的魚種數量相同，每組數量不少於30尾）。攻毒後的魚種在（25～28）℃的水體中觀察15d，記錄各組的死亡魚數，計算死亡率。

9.3　免疫保護率的計算

根據9.2條的試驗結果，計算其免疫保護率。

免疫保護率(%)=（對照組魚種死亡率一試驗組魚種死亡率）/對照組魚種死亡率×100%

注: 免疫保護率在65%以上的製品為合格品。

10　產品分裝與保存

　　將滅活、安全性和效力檢測合格的疫苗在無菌條件下，分裝於50ml或100ml經消毒處理的玻璃瓶或塑料瓶中，加貼標簽，包裝產品。產品包裝按GB 6388的要求執行。疫苗產品置於4℃環境下冷藏備用，有效期為90d。在疫苗保存期間，應不定期進行無活菌檢驗，以保障疫苗的安全性。

11　留樣待檢

　　每批產品留樣(3～5)瓶，保存90d。

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