一 實驗目的
1、掌握厭氧菌的分離、培養及活菌計數的一般方法。
2、觀察雙歧杆菌的形態特征並了解雙歧杆菌的生長特性。
3、了解雙歧杆菌鑒定的一般方法。
二 基本原理
厭氧微生物在自然界分布廣泛,種類繁多,其生理作用日益受到人們的重視。雙歧杆菌是專性厭氧菌,對氧氣非常敏感,因此,雙歧杆菌的分離、培養及活菌計數的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養環境。
雙歧杆菌的最適生長溫度
雙歧杆菌的培養方法很多,如厭氧箱法、厭氧袋法、厭氧罐法。這些方法都需要特定的除氧措施,操作步驟多,較繁瑣。本實驗介紹的是一種簡便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術,亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特於1950年首次提出並應用於瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術 。以後這項技術又經曆了幾十年的不斷改進,從而使亨蓋特厭氧技術日趨完善,並逐漸發展成為研究厭氧微生物的一套完整技術,而且多年來的實踐已經證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術。該技術的優點是:預還原培養基製好後,可隨時取用進行試驗;任何時間觀察或檢查試管內的菌都不會幹擾厭氧條件。
目前,雙歧杆菌鑒定的方法有很多種。近年來興起的一種新的RAPD等分子生物學技術對雙歧杆菌進行基因指紋圖譜的構建,分析不同雙歧杆菌種間存在的同源性和多態性;RAPD技術也可用於雙歧杆菌菌種鑒定及分型。一般來講,我們都應用適合鑒定所有厭氧菌的方法,主要包括雙歧杆菌特定酶的檢測、乙酸、乳酸等有機酸的測定、糖發酵試驗和其他相關指標等。
三 實驗用具
高純氮氣 厭氧管 注射器 培養箱 冰塊 水浴鍋 鑷子 記號筆 MRS培養基 細菌生化微量鑒定管 酒精棉球 瓷盤 振蕩器 銅柱除氧係統 定量加樣器 恒溫水浴 載玻片 顯微鏡 恒溫培養箱 超聲波破碎儀 濾紙 層析缸 酒精燈 封口膜 厭氧罐 等。
四、實驗方法與步驟
1 銅柱係統除氧
銅柱是一個內部裝有銅絲或銅屑的硬質玻璃管。此管的大小為40~
2 預還原培養基及稀釋液的製備
製作預還原培養基及稀釋液時,先將配置好的培養基和稀釋液煮沸驅氧,而後用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中,一般瓊脂培養基裝4.5~5.0mL,稀釋液裝9mL,並插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時可以清楚的看到培養基內加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅最後變成無色,說明試管內已成為無氧狀態,然後蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋,滅菌備用。
3 分離
(1)編號
取五支無菌水試管,分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5。
(2)稀釋
在無菌條件下,用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品,加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中,用震蕩器將其混合均勻,製成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中,製成10-2稀釋液。依此進行10倍係列稀釋,至10-7,製成不同樣品稀釋液。通常選10-5、10-6、10-7三個稀釋度進行滾管計數。
(3)滾管分離
a、滾管
將無氧無菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化,置46
b、分離
生成的菌落需挑取出來,鏡檢其形態及純度。如尚未獲得純培養物,需再次稀釋滾管,並再次挑取菌落,直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定,做好標記。然後將培養基試管固定於適當的支架上,打開試管膠塞,同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內。同時,另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內,找準待挑菌落,輕輕吸取,轉移至液體試管內,加塞。
4 計數並鏡檢
(1)計數
液體純培養物經係列稀釋後,按上述滾管法培養。然後對固體滾管計數,計算每克或每毫升樣品中含有的雙歧杆菌數量。公式如下:
雙歧杆菌數量cfu/g(mL)樣品=0.1mL滾管計數的實際平均值×10×稀釋倍數
(2)鏡檢
挑取特征性菌落製片,革蘭氏染色後鏡檢,觀察菌體形態。
5 菌種鑒定
⑴ 雙歧杆菌特定酶的檢測
利用果糖-6-磷酸鹽對分離得到的菌種進行果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶(F6PPK)的測定,初步確定菌種是否為雙歧杆菌屬。F6PPK測定的操作如下:
① 將從樣品中分離出的雙歧杆菌培養於厭氧液體改良MRS培養基中
② 將菌液4400 rpm離心10 min,收集菌體,緩衝液ⅰ洗滌2次,最後溶於約4 mL緩衝液ⅰ中,製成細菌懸液。
緩衝液
ⅰ 現用現配。取
③ 用超聲波粉碎儀,400 W條件下;每處理5 s、間隔5 s,超聲粉碎8 min,至菌體溶液呈半透明。
④ 破碎後,取0.5 mL 於離心管中,加試劑ⅱ和ⅲ各125 µL,
ⅱ 6 mg/mL氟化鈉加10 mg/mL 碘乙酸鈉。
ⅲ 果糖-6-磷酸鹽80 mg/mL水溶液。
⑤ 加試劑ⅳ 0.750mL, 室溫10 min。
ⅳ 現用現配。鹽酸羥胺139 mg/mL。酸性極強,用氫氧化鈉中和至pH6.5。
⑥ 加試劑ⅴ和ⅵ各500 µL, 室溫5 min。
ⅴ 三氯乙酸(TCA)水溶液
ⅵ
⑦ 加試劑ⅶ 500 µL, 顯色。紅褐色或紅紫色為陽性,黃色為陰性。
ⅶ
⑵ 乙酸、乳酸等有機酸的測定——紙層析法
① 層析濾紙的製備——將層析濾紙剪成
② 配製展開劑——正丁醇:甲酸:水=80:15:5
③ 配製標準液——配製1.5%的乳酸、1.5%的乙酸溶液
④ 製備待測樣品——將菌種
⑤ 點樣——用毛細管分別吸取發酵液,多次點樣於濾紙條上,樣點直徑不宜超過
⑥ 層析——將點好樣的層析紙放入,使點有樣品的一端浸在展開劑中,但不可浸及樣點。觀察展開情況,待展開劑前沿到達離層析紙另一端約
⑦ 顯色——以3%溴甲酚藍酒精溶液為顯色劑,待層析液揮發之後,向層析濾紙噴灑並計算Rf值。
注釋:物質被分離後在紙層析圖譜上的位置是用Rf值 (比移值 Rf value 又稱Rf值) 來表示:
Rf = 原點到層析中心的距離 / 原點到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質的Rf值是常數。Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑係統、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關,是一個定性分析的重要參數。
⑶糖發酵試驗
糖發酵實驗是最常用的生化反應,在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源,但是它們在分解糖的能力上有很大差異,有些細菌能分解糖並產酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌隻產酸不產氣。例如大腸杆菌能分解乳糖和葡萄糖產酸並產氣;傷寒杆菌能分解葡萄糖產酸不產氣,不能分解乳糖;普通變形杆菌分解葡萄糖產酸產氣,不能分解乳糖。酸的產生可以利用指示劑來斷定。在配製培養基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8(紫色)],當發酵產酸時,可使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。
本實采用現成的細菌生化微量鑒定管 ,鑒定管的種類如下:
乳糖 麥芽糖 甘露糖 甘露醇 蔗糖 阿拉伯糖 D-核糖 木糖(木膠糖) 半乳糖 鬆三糖 山梨糖 澱粉 水楊素 葡萄糖酸鹽 草糖(海藻糖) 血清菊糖 棉子糖 果糖 蜜二糖 纖維二糖
具體實驗步驟:
① 將菌液進行適當稀釋,之後在無菌環境下,取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中,用無菌封口膜封口。
② 將接種後的鑒定管放入厭氧罐中,充足氮氣後放入
③ 24h後觀察各管中液體變顏色情況,若變色則為陽性,反之陰性,對照淩代文編著的《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》“鑒別雙歧杆菌屬內種的特征”表即可初步確定其種別。
五 注意事項
1 注射器在使用前必須經過
2 注意無菌操作,保持手和培養管的清潔。每次接種前需用酒精棉球將厭氧管蓋子擦一遍。
3 用注射器吸取菌懸液注入固體培養基後,如需再次吸取,應快速將注射器插入厭氧管中,以防止針頭汙染。
六 實驗結果記錄
(下列表格供參考)
表一 雙歧杆菌培養過程中菌落計數
稀釋度 |
10-4 |
10-5 |
10-6 | |||||||||
菌落數 |
1 |
2 |
3 |
平均 |
1 |
2 |
3 |
平均 |
1 |
2 |
3 |
平均 |
|
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| |
每毫中 總活菌數 |
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表二 雙歧杆菌菌株屬的鑒定指標與鑒定結果
鑒定項目 |
試驗結果 |
鑒定項目 |
試驗結果 |
革蘭氏染色 |
|
乙酸含量 |
|
細胞形態 |
|
乳酸含量 |
|
F6PPK |
|
乙酸:乳酸 |
3:2 |
表三 雙歧杆菌菌株糖醇發酵試驗結果
試驗項目 |
結果 |
試驗項目 |
結果 |
D-核糖 |
|
甘露糖 |
|
L-阿拉伯糖 |
|
果 糖 |
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乳 糖 |
|
半乳糖 |
|
纖維二糖 |
|
蔗 糖 |
|
鬆三糖 |
缺 |
麥芽糖 |
|
棉子糖 |
|
海藻糖 |
|
山梨醇 |
|
蜜二糖 |
|
澱 粉 |
|
甘露醇 |
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葡萄糖酸鈉 |
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菊 糖 |
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木 糖 |
|
水楊苷 |
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注:表中+表示待測菌株陽性,-表示待測菌株陰性
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