植物組培步驟

 

      按照上表配成100倍母液8種，各配成1L，各種母液配完後，分別用玻璃瓶貯存，並且貼上標簽，注明母液號、配製倍數、日期等，保存在冰箱的冷藏室中

MS培養基中還需要加入萘乙酸（NAA）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）等植物生長調節物質，並且分別配成母液（1 mg/mL）。其配製方法是：分別稱取這2種物質各100mg， NAA用少量乙醇溶解，6-BA用少量的NaOH溶液，溶解過程需要水浴加熱，最後分別定容至100 mL，即得1mg/mL的母液。

1當量氫氧化鈉：稱取4g氫氧化鈉，加蒸餾水定容到100mL。

1當量鹽酸：量取濃鹽酸9mL，加蒸餾水定容到100mL。

用量筒或移液管從各種母液中分別取出10ml, 與各種母液一起放入燒杯中。然後量取所需濃度的NAA或6-BA加入燒杯中，稱取蔗糖30g,加入燒杯後，定溶到1L。

調pH值  用酸度計或PH試紙測溶液PH值（可用1當量的氫氧化鈉和1當量的鹽酸調節PH值直到培養基的pH為5.8為止），培養基的pH必須嚴格控製在5.8。

稱取5g左右瓊脂粉倒入燒杯中，然後在電爐上加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。

培養基的分裝  溶化的培養基應該趁熱分裝。將燒杯中的培養基倒入培養瓶中，注意不要讓培養基沾到瓶口和瓶壁上。每1L培養基，可分裝25～30瓶。

培養基分裝完畢後，用硫酸紙或封口膜及時封蓋瓶口。如果組培瓶有蓋則蓋上蓋子。

增殖培養基：MS+BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉 5g/L

生根培養基：MS+ NAA0.2+蔗糖30g/L+瓊脂粉 5g/L

培養基配方是在不斷實踐摸索中，才能找到最適合的培養基。

 

將分裝好的培養基放入高壓蒸氣滅菌鍋滅菌
    培養基在製備後的24小時內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。
    注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排淨空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電後，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零後，再關閉放氣閥。
    關閥再通電後，壓力表上升達到0.1MPa時，開始計時，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鍾。

到達保壓時間後，即可切斷電源，在壓力到0.5MPa，可緩慢放出蒸汽，應注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當壓力降到零後，才能開蓋，取出培養基，擺在平台上，以待冷凝。不可久不放氣，引起培養基成分變化，以至培養基無法擺斜麵。一旦放置過久，由於鍋爐內有負壓，蓋子打不開，隻要將放氣閥打開，大氣壓入，內外壓力平衡，蓋子便易打開了

滅好菌後，讓培養基自然冷卻凝固。最好放置1 d後再使用

植物材料表麵用消毒劑滅菌
    從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些汙染源一旦帶入培養基，便會造成培養基汙染。因此，植物材料必須經嚴格的表麵滅菌處理，再經無菌操作手續接種到培養基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體（explant)。
    首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗幹淨，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水衝洗幾分鍾至數小時，衝洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內衝洗。流水衝洗在汙染嚴重時特別有用。
    洗時可加入洗衣粉清洗，然後再用自來水衝洗洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表麵的汙物，除去脂質性的物質，便於滅菌液的直接接觸。當然，最理想的清洗物質是表麵活性物質吐溫。
    第二步是對材料的表麵浸潤滅菌。要在超淨台或接種箱內完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由於酒精具有使植物材料表麵被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內部的材料，則可隻用70%酒精處理稍長的時間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發後再剝除外層，取用內部材料。
    第三步是用滅菌劑處理。表麵滅菌劑的種類較多，可根據情況選取1-2種使用見下表。

常用滅菌劑使用濃度及效果比較表

滅菌劑名稱	使用濃度%	消毒難易	滅菌時間	滅菌效果
氯化汞	0.1-0.2	較難	2-10	最好
漂白粉	飽和溶液	易	5-30	很好
次氯酸鈉	2（活性氧）	易	5-30	很好
過氧化氫	10-12	最易	5-15	好

    上述滅菌劑應在使用前臨時配製，氯化汞可短期內儲用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產生氯氣來殺菌的，故滅菌時用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌後用無菌水漂洗3-4次即可；由於升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒去除，所以應當用無菌水漂洗8-10次，每次不少於3分鍾，以盡量去除殘毒。
    滅菌時，不瀝幹的植物材料轉放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒入消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前1-2分鍾，開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內，要注意勿使材料倒出，氫淨後立即倒入無菌水，輕攪漂洗。滅菌時間是從倒入消毒液開始，至倒入無菌水時為止。記錄時間還便於比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒材料。寧可多用些滅菌液，切勿勉強在一個體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。
    在滅菌溶液中加吐溫-80或Triton X效果較好，這些表麵活性劑主要作用是使藥劑更易於展布，更容易浸入到滅菌的材料表麵。但吐溫加入後對材料的傷害也在增加，應注意吐溫的用量和滅菌時間，一般加入滅菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。
    最後一步是用無菌水漂洗，漂洗要求3分鍾左右，視采用的消毒液種類，漂洗3-10次左右。無菌水漂洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。

接種在超淨台上操作，接種前超淨台上和接種間的紫外線燈開30分鍾以上殺菌。

在無菌操作時，把鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻後，立即使用。操作中可采用250或500毫升的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。

 

 

接種步驟

1）將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超淨台上，用消毒劑滅菌，再用無菌水衝洗，最後瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或濾紙上。

（2）材料吸幹後，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對材料進行適當的切割。如葉片切成0.5cm平方的小塊；莖切成含有一個節的小段。微莖尖要剝成隻含1-2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經常灼燒接種器械，防止交叉汙染。

（3）用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養基上。具體操作過程（以試管為例）是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，並將管口在火焰上方轉動，使管口裏外灼燒數秒鍾。若用棉塞蓋口，可先在管口外麵灼燒，去掉棉塞，再燒管口裏麵。然後用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內，輕輕插入培養基上。若是葉片直接附在培養基上，以放1-3塊為宜。至於材料放置方法除莖尖、莖段要正放（尖端向上）外，其他尚無統一要求。接種完後，將管口在火焰上再灼燒數秒種。並用棉塞，塞好後，包上包口紙，包口紙裏麵也要過火。