澱粉酶的固定化生產

一、實驗目的：

學習細胞固定化的原理，通過海藻酸鈉包埋固定產澱粉酶的枯草芽孢杆菌，掌握菌體包埋固定的基本方法，了解固定化細胞在實際中的應用。

二、 實驗原理：

細胞固定化克服了傳統遊離細胞發酵的不足，本實驗以海藻酸鈉為載體，以CaCl2為交聯劑，進行固定化枯草芽孢杆菌。海藻酸鈉是從海藻提取獲取的藻酸鹽，為D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的線性共聚物，多價陽離子（如Ca2+）可誘導凝膠。

三、 實驗材料：

1.菌株：枯草芽孢杆菌。

2.發酵培養基：葡萄糖：4%；蛋白腖：1%；磷酸二氫鉀：0.5%；七水硫酸鎂：0.2%酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。

3.固定化用培養基：澱粉：2％；葡萄糖：0.5%；蛋白腖：1%；磷酸二氫鉀：0.5%；七水硫酸鎂：0.2%；酵母膏：0.5%，pH：5.5-6.5。

四、實驗步驟：

（1）培養基滅菌：取250mL三角瓶，分別放入配好的液體培養基100ml，滅菌冷卻。

（2）種子活化和接種：將枯草芽孢杆菌接入培養基，30℃培養活化，取活化後的枯草芽孢杆菌分別接入已滅菌冷卻的三角瓶培養瓶，振蕩混勻。

（3）培養：將已接種的三角瓶培養液置於振蕩培養箱，200r/min，25℃培養三天，離心收獲菌體並用無菌水洗滌一次，製備菌懸液，使其中枯草芽孢杆菌菌數為2.3×107個/ml。

（4）海藻酸鈉及交聯劑的製備：

海藻酸鈉溶液的製備：取海藻酸鈉1.5g，2.0g，2.5g，3.0g，3.5g，分別置於250ml三角瓶中，各加入100ml蒸餾水，放置並攪拌，滅菌。

交聯劑的製備：配製2%濃度的CaCl2，滅菌。

（5）固定化枯草芽孢杆菌的製備

將枯草芽孢杆菌細胞菌懸液與海藻酸鈉溶液按照1∶1 充分混勻後,用一注射器,將混合液滴入交聯劑中, 交聯劑的陽離子從外部擴散進入海藻酸鈉枯草芽孢杆菌混合液珠內, 將細胞包埋其中。製成凝膠小球，使酵母固定化，用無菌水洗滌固定化細胞，然後加入2% CaCl2，平衡24 h即可使用。

（6）固定化細胞的增殖：將固定化細胞轉入固定化增殖培養基25℃，pH6下培養。

5 實驗結果

   利用DNS法檢測培養液中葡萄糖濃度，以確定是否產生了澱粉酶，經過一段時間培養，滴入碘液，看是否有藍色產生。

六、思考題

1、固定化細胞有何優點和缺點？

2、對細胞或者酶進行固定的方法還有哪些？

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