通過控製培養和培養條件進行分離工業微生物產生菌

各種微生物對營養要求和培養條件是不同的，在分離篩選時若在這兩個方麵加以調節控製，就能獲得更好的分離效果。

1.培養基的營養成分

各種微生物對碳源、氮源要求各異，有的對營養還有特殊的要求，事先了解被分離微生物的營養要求，從而設計一個合理快速的分離培養基，能夠收到事半功倍的效果。

放線菌是生產抗生素和酶製劑的重要來源。在選擇分離放線菌時，通常采用改良的HV瓊脂培養基、土豆-胡蘿卜水汁液培養基和澱粉瓊脂培養基能取得較好的效果。但不同菌種對營養要求差別很大，如奴卡氏菌在有氧條件下用普通培養基即可分離到，而以色列放線菌則在有CO₂存在且有適宜培養基的情況下才能正常生長繁殖。

篩選水解酶產生菌時，通常利用以底物為惟一碳、氮源的平板進行分離，如以澱粉為碳源的培養基可鑒定菌落能否產生澱粉酶；一種含纖維素粉為碳源的分離培養基，可以鑒別纖維素酶產生菌；用含有酪蛋白為有機氮源的平板培養基，可以鑒別蛋白酶的產生菌。純種分離時，把以上瓊脂平板置於適宜的溫度培養一定的時間，如具有產生水解酶能力的菌株，便在菌落四周形成水解圈或呈色圈，根據圈的大小可初步判斷酶活力強弱。測定水解圈直徑與菌落直徑之比，把比例大的菌落移入斜麵保藏，供進一步篩選。

2.培養基的pH

細菌、放線菌的生長繁殖對pH一般要求偏堿，黴菌和酵母菌要求偏酸。因此，分離培養基的pH應該調節到被分離微生物要求範圍。這不僅有利於自身生長，也可排除一部分不需要的菌類。例如，分離檸檬酸產生菌的黑曲黴，就是利用調節培養基的酸堿度獲得成功的。其分離方法是：取紅芋粉醪20%、檸檬酸10%～20%配成培養液，調節pH2.0～2.5，以一定量的培養基和土樣均勻混合，用毛細吸管點種在平皿內事先覆蓋的無菌濾紙上（2～3層），於30℃培養，這樣可以分離到產生檸檬酸的黑曲黴。

分離堿性蛋白酶和堿性脂肪酶產生菌時，可以把培養基調到pH 9～11，在此範圍內不宜生長的微生物被抑製，這對分離本身起到濃縮作用。大多數水解酶的生長最適pH基本相近，而酶的作用pH未必與產酶pH相同。

培養基的pH要結合營養成分和培養條件來考慮。因為微生物在生長繁殖過程中，由於代謝作用會產生酸性或堿性產物，pH發生變化，微生物生長受到抑製。一般培養基中碳氮比（C/N）高者，培養後傾向於酸性，反之則傾向於堿性。無機鹽的性質也會影響pH變化，（NH₄）₂SO₄是生理酸性無機氮源，其中NH4+被菌體利用，留下SO₄^2-，培養液變成酸性。而NaNO3是生理堿性氮源，其中NO₃^—被菌體分解利用後，剩餘Na+，使培養液變成堿性。如發酵過程缺氧，則代謝向有機酸合成方向進行，pH下降。為了維持培養基的ph，一般要加磷酸鹽，如K₂HPO₄、KH₂PO₄，使培養基具有一定的緩衝能力。如果培養液中的酸堿變化很大，磷酸鹽的緩衝容量不足以調節pH變化，則可適當加入碳酸鈣，以不斷中和菌體代謝過程中產生的酸類，使培養基的pH能保持在恒定的範圍內。此外，在分離黴菌時，加幾滴乳酸不僅可以維持一定酸堿度，而且可以抑製細菌的生長。

3.排除不需要的菌類

采取調節pH的方法來抑製非目的微生物的生長，雖然能起到一定的作用，但並不是對所有的菌類都有效。有些細菌和放線菌同樣可以在酸性環境下生長，而個別的黴菌，也同樣可以在中性或偏堿的培養基中生長。為了更有效地抑製非目的微生物的生長，要加入一些專一性的抑製劑。

（1）分離細菌時，在培養基中加入濃度為50U/ml製黴菌素，可以抑製黴菌和酵母菌的生長。

（2）分離放線菌時，在樣品中加入0.05%十二烷基磺酸鈉（SDS）不僅可以抑製細菌的生長，還能激活放線菌孢子的萌發。加入氟呱酸（5mg/L）+製黴菌素（50mg/L）+青黴素（0.8mg/L）也可以有效地抑製細菌和真菌，而不影響放線菌的生長。

（3）分離黴菌和酵母菌時，在培養基中加入青黴素、鏈黴素和四環素各30U/ml，可以抑製細菌和放線菌生長。

（4）分離根黴和毛黴時，由於這些微生物的菌絲易蔓延成片，難以得到純化的菌落，通常在培養基中添加0.1%去氧膽酸鈉或山梨醇防止菌絲蔓延，使菌落長得小而緊密。

一般用於分離單一目的微生物的培養基中均含有抑製其他微生物的抑製劑，這些專用的抑製劑在小型實驗室配製較麻煩，現已有成品供應，隻要直接加入基礎培養基即可。如氨苄西林，主要用於分離親水氣單孢菌。

4.控製培養溫度

控製培養溫度，也是一種獲得目的微生物的有效措施。各類微生物生長溫度不同，從大範圍來看，可分三大類：一類是高溫微生物，最適溫度在50～60℃。如果要分離這類菌可將分離培養基置於50～60℃溫度下培養，能抑製一些嗜冷、中性微生物生長，可以有效地分離到高溫菌類。第二類是中溫微生物，它們的最適生長溫度是20～40℃，超過50℃，就停止生長。這類微生物最為常見，、數量都占首位。工業發酵微生物絕大多數都屬於此類。其中不同類群微生物對溫度又有所差別，一般細菌、放線菌最適溫度為25～37℃，黴菌和酵母最適溫度為20～28℃。第三類為低溫微生物，它們的最適溫度為15℃或更低。當從樣品中分離各種菌類時，分別置於自身最適溫度下培養也可大體上抑製另一些微生物的生長。當分離某些特殊產物的微生物時，對溫度的選擇還需考慮某些內在的關係，如在篩選不飽和脂肪酸產生菌時，由於細胞膜中所含的不飽和脂肪酸含量越高，其凝固點越低，即細胞在較低溫度下仍能表現出活力，因此在低於正常溫度10℃下分離效果最好。

三、厭氣菌的分離

好氣菌要在有氧條件下培養，嫌氣菌要在厭氧狀況下才能生長。工業發酵所用菌種為厭氣菌的有丙酮丁醇的梭狀芽孢杆菌，白酒增香用的丁酸菌、己酸菌及用於環境汙水處理和水產養殖用的光合菌、反硝化菌、脫氮排硫杆菌等。它們生長於水底層及沉積物中，要從樣品中分離這類菌，需采取厭氣培養法，否則菌體因接觸氧氣而死亡。因此，培養過程中要除去氧氣，現介紹如下幾種方法：

（一）加還原劑

分離培養基內加入還原劑，如半胱氨酸、D型維生素C、硫化鈉等，操作時以最快的速度劃線分離，然後立即置於事先已抽真空密閉的容器內（充CO₂或N₂也可），於室溫培養。

（二）焦性沒食子酸法

焦性沒食子酸和NaOH互相反應除去氧氣。操作時，先將焦性沒食子酸放在容器中，把含有厭氧菌樣品的培養皿架空放入容器內，然後加入NaOH溶液，立即蓋上蓋子，並用石蠟或凡士林密封，放到室溫下培養。要除去100ml空氣中的氧氣需要焦性沒食子酸固體1g和10%NaOH溶液10ml。

（三）平皿厭氣培養法

取無菌培養皿一套，在皿蓋內  到上分離培養基，凝固後，皿底一側放焦性沒食子酸固體，另一側放10%NaOH溶液，使二者不相接觸。準備完畢，在凝固的瓊脂平板上迅速把含厭氧菌樣品進行劃線，然後蓋上皿蓋並密封，搖動平皿使焦性沒食子酸固體和NaOH溶液混合，發生化學反應，除去皿內的氧氣，置適宜溫度下進行培養。

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