細菌鞭毛染色方法及其應用（上）

一、細菌鞭毛染色方法

　　目前，細菌鞭毛染色方法根據染色劑的不同，可分為堿性複紅法、副品紅法、結晶紫法、維多利亞藍B法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類，前5類方法的媒染劑成分中均含有單寧酸，染色原理通常是采用不穩定的膠體溶液做媒染劑，並使其沉澱於鞭毛上而使“鞭毛腫脹（tar and feather）”，鞭毛直徑加粗，進一步染色後即可在油鏡下觀察。

1. 堿性複紅法和副品紅法：

　　1926年由Gray首創堿性複紅法，其媒染液成分包括20%丹寧酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞水溶液2ml，3%堿性複紅乙醇（95%）溶液0.4ml，臨用前混合，且需過濾後方可使用。染片時，媒染劑染色約6min，具體時間尚需在試驗中摸索確定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸複紅染液，染片時需要1小片吸水紙蓋在塗片上，染色3min。由於該方法媒染劑混合物不穩定、操作複雜、經驗性強。Leifson於1930年建立了副品紅法，並於1938年和1951年兩次對該方法進行了改良，稱為Leifson方法。染色試劑由3種溶液組成：A為1.5%NaCl水溶液，B為3%單寧酸水溶液，C為乙酸副品紅0.9g，堿性副品紅0.3g溶解於100ml 95%乙醇溶液中。使用時把等體積A和B混合，然後再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可保存1～2個月。

　　盡管Leifson方法的試劑可以冷藏保存1～2個月，比Gray法進步了，但Gray法、Leifson法仍存在試劑穩定性較差的問題；並且製備塗片程序亦繁鎖，如細菌要接種營養瓊脂斜麵，製備塗片前要用蛋白腖水懸浮培養物斜麵0.5 h，然後用該菌懸液化氣製塗片；缺乏對染色效果方法的評價。

　　1976年，Clark在Leifson法的基礎上，通過大量試驗解決了3個重要問題：首先，製備塗片時可以直接從Columbia瓊脂血平板上取菌製備；；其二，可運用打分的方法進行染色效果評價；；其三，首次證明了血平板培養和肉湯培養的細菌鞭毛染色效果無差別。未使用Leifson法中的副品紅染色劑，而使用了Gray法中的堿性複紅染色劑。

　　具體配方：1.2%堿性複紅，1.5%單寧酸和0.75%NaCl，95%乙醇溶解堿性複紅後，過夜使用。用1 mol/L NaOH溶液調pH至5，染液需4℃保存，穩定1個月。

　　Clark雖然使用了3分製評分標準評價染色效果，但由於沒有解決染色液的穩定性差的問題，仍不夠完善。1981年Forbes在前人的基礎上對堿性複紅法進一步改良其配方：0.4g堿性複紅，0.2g單寧酸和0.5g硫酸氨鋁，裝於16 mm×125 mm的試管中，密閉保存。染色前，用2 ml 95%乙醇，0.5ml甘油，7.5ml Tris緩衝液混合物使其溶解，充分搖動3～5min，2500r/min離心2min，室溫反應30min後使用。試管中的混合液加入礦物油後，室溫下能保存2周。Gray法、Leifson法及Clark法的染色時間均需要試驗摸索，Clark改良法的時間為5～15min，Forbes法則隻需1min，但Forbes法對於腸杆菌科的染色效果不理想，除了變形杆菌，評分值都在3分以下。Forbes仍未解決染色試劑穩定性差的問題。

2. 結晶紫法：

　　又稱Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等進行了改良。媒染劑：5%石碳酸10 ml，2g單寧酸和10 ml飽和硫酸鉀鋁。染色劑：飽和結晶紫乙醇溶液，即12g結晶紫溶於100 ml無水乙醇中。使用時把10份媒染劑與1份染色劑混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑，采用濕片技術進行鞭毛染色，雖然可以觀察到細菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法優點是試劑比較穩定，目前Difco公司已經研製出該方法的商品試劑盒，但染色效果亦不甚理想，至今尚無一篇文獻對其方法進行評分評。

3. 維多利亞藍B法：

　　1990年由Inoue等報道日本製藥株式會社Shionogi Seiyaku研製出一種細菌鞭毛染色商品試劑盒。其試劑組成包括維多利亞藍B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁，染色約需7min。該試劑保存期約為6個月，關於其染色效果雖然有過一篇文獻評述，但卻沒有采用評分法進行評價，很難判斷其染色效果。

4. 鍍銀染色法：

1958年Rhodes根據Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法，建立了一種細菌鞭毛鍍銀染色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。

媒染液：10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液，再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉澱，通過搖動又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，穩定10 min後使用。

　　銀染液：配製5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml備用，再緩慢加入濃氨水（比重0.880）使形成的沉澱剛好重新溶解，最後把備用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到搖動後呈現輕微而穩定的薄霧狀溶液為止，避光保存，可穩定數周。

　　用媒染液染片3～5min，蒸餾水充分洗滌後，再把銀染液滴加至塗片上。加熱至接近沸騰，染色3～5min。由於Rhodes鍍銀染色法媒染液成分複雜、操作繁鎖，所以1965年Blenden等改良了細菌鞭毛鍍銀染色法的配方。試劑A：100 ml蒸餾水中加入5 g單寧酸，1.5 gFeCl3，15%福爾馬林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。試劑B：使用2% AgNo3，其他同於Rhodes，但試劑不穩定，要求在4h內使用，並用要用氨水調pH至10。試劑A染片2～4min，試劑B染色30 s，不需加熱。由於以上兩種鍍銀染色方法都要使用營養瓊脂斜麵培養物，並且需用無菌蒸餾水懸浮菌液製片，未采用評分法評價鍍銀染色方法。因此1977年，West等對鍍銀染色法進一步改良，製備塗片時直接使用血平板，評價染色效果首次使用5分製，通過該評價方法證明了加熱銀染液染片可以提高染色效果。

　　試劑配方：媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml，10%單寧酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配製同Rhodes，但需避光5℃保存。

　　媒染液染片4min，銀染液滴加至塗片上加熱至微冒蒸汽，染色4min。同時West等還對使用不同培養基進行染色效果評價，包括半固體動力培養基、血瓊脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜麵，其中半固體動力培養基和TSA斜麵25℃，培養18～24h；血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h。評價結果血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h不適於細菌鞭毛染色，而半固體動力培養基和TSA斜麵25℃，培養18～24h適合於細菌鞭毛染色，同時也證明了使用福爾馬林處理標本製備塗片並不能有效阻止鞭毛脫落。由於鍍銀染色法媒染液不穩定，需避光5℃保存，1992年Porter等繼續改良該方法，其試劑配方同West等的方法，隻是媒染劑避光室溫可保存數月，延長媒染劑染色時間為8 min，染色液不需加熱，隻染30 s，製備塗片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培養24h，但遺憾的是Porter等隻使用了1種細菌（奇異變形杆菌）進行研究。於是1994年Finegan等進一步證實使用過期媒染劑進行鍍銀染色可以增強鞭毛染色效果，並使用4種細菌（綠膿假單胞、奇異變形杆菌、黏質沙雷菌、枯草芽孢杆菌），用trypitcase soy肉湯及其瓊脂平板，26℃培養24h。試劑配方仍不變，媒染液放置1、2、4、8、16周後進行染色，媒染液染色8 min，銀染液染色30～60 s，不需加熱。這4種細菌均染色成功，從而證明媒染液可至少放置16周。

　　2002年穀海瀛發明了一種新的細菌鞭毛鍍銀染色法。該法將媒染劑分為A、B兩種。A液為酸化FeCl3溶液，B液為15%單寧酸，含甲醛1 ml，用時A、B液等量混合，輕微加熱，染片40s，再用銀染液塗片加熱至微冒蒸汽，染色10 s。通過對19個屬，34個種，228株細菌進行鞭毛染色，應用West等的染色效果評價方法進行評價。血瓊脂平板培養平均每株菌獲得4.7分，肉湯培養平均每株菌獲得4.6分，其中100株非發酵菌在血平板培養獲得滿分5分。重要的是這種方法不僅染色效果好，而且解決了試劑穩定性差的問題，此種試劑常溫下至少可保存1年。

5. 熒光蛋白染色法：

　　2000年，Grossart等報道了一種熒光蛋白染色法該方法是在玻片上加10μl活細菌液體培養物，再加0.5μl熒光染色劑（nanoOrange），然後加30%聚乙烯吡咯烷酮10～20μl，蓋上蓋玻片，10～15min後使用放大倍數×1250，激發波長490nm，發射波長520 nm的落射熒光顯微鏡（epifluores cence microscopy）觀察。研究中共檢測了37株細菌，其中有動力的6株細菌未觀察到鞭毛。這種新方法不適合於在臨床微生物實驗室常規開展，因為結果觀察時必須借助特定的設備，細菌培養必須使用液體培養基，其可靠性還有待進一步驗證。

　　綜上所述，無論是堿性複紅法、副品紅法、結晶紫法、維多利亞藍B法，還是傳統鍍銀染色法都無法克服試劑不穩定這一最大的缺點。結晶紫法雖然試劑比較穩定，但染色效果卻不理想。穀海瀛發明的細菌鞭毛鍍銀染色法操作簡便、快速、試劑穩定、重複性好，可以作為實驗室常規鞭毛染色方法推廣應用。

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