海洋放線菌分離方法

關鍵詞：海洋放線菌，分離方法

中圖分類號：Q93   文獻標識碼： A   文章編號：0253-2654(2006) 06-00-0 

海洋占地球表麵的70％，那裏是一個廣闊的立體生物世界。而人們對海洋微生物的研究和利用遠遠不及陸地。從陸地微生物發現新的高活性物質越來越困難的今天，人們把目光投向海洋是很自然的。Mincer等從Bahamas，Red Sea，Egypt，Sea of Cortez，Mexico等海域采集海底泥樣品，分離到上萬株 Micromonospores，將其中MAR 1群菌株定為鹽生孢菌屬 (Salinispora ) ，認為這些物種廣泛分布於不同的海域。2005年，Antonie van  Leeuwenhoek雜誌用一整期刊登 Bull和Goodfellow主編的海洋放線菌 (Actinibacteria )研究的成果。從 0m一200m深度的采集的樣品，有大約 9％的放線菌可以獲得純培養；200m～2O00m，有0.1％ ～17.0％；2O00m～6000m，有0.8％～14％；6000 m以下，僅有0.5％～0.8％可以獲得純培養。在許多海域，海底泥表麵的微生物中，放線菌還會占優勢，其中小單孢菌科所占比重較大。目前已發現的放線菌還有Streptomyces，Dietzia，Rhodococcus， Salinospora，Marimomyces，Aeromicrobium，Salinibacterium，Verrucosispora，Aureobacterium，Dermacoccus，Kocuria，Xestospongia ． Gordonia，Micrococcus，Brachybacterium，Acidimicrobium，Microthrix等。可見，海洋放線菌是大有開發潛力的微生物資源。 

最近幾年的工作證明，從海洋放線菌發現新生物活性物質的幾率甚至超過陸生放線菌。從海洋放線菌獲得的部分活性物質有gfiseorhodin  A，salinosporamide  A、B，marino ne，lavanducyanin，gutingimycin，salinamide，tetrodotoxin，Pyrostain A 和B，Pyrizinostatin，sporolides A、B，marinomycin A、B，tetracenomycin  D1，Chromomycin A3， Enterocin，Actp henol，maltophilin，echinomycin，antimycin  A，sporaviridin  A1， bafilomycins，filipin，lipomycins，lagosin，aboyssomicins， ikarugamycin，elalomycin，prridindolol，saphenoc  acid ，1-N-methyl-( E，Z )一albonoursin，1，6-dihydroxyphenazine，Bu-4664L等等。 

我國有廣闊的領海，但是對海洋放線菌的研究和開發利用都做得很不夠。為了研究海洋放線菌的多樣性，進一步進行開發利用，首先就要進行分離。下麵介紹一些實用的分離方法。 

1 樣品采集及處理

為了排除陸地微生物，最好選擇遠離人類幹擾的所謂“ 原始天然海域”作為研究對象。 

一般用斯庫巴自攜式水下取樣器采集底泥或水樣。樣品置於塑料瓶，4℃保存，4h以內用如下兩方法處理：( 1 )1mL底泥，加4 mL無菌海水，55℃  6min ，馬上做分離；( 2 )10mL底泥樣品鋪於無菌培養皿內，真空幹燥約24h ，磨細成粉末，稀釋後做分離。在取樣的同時，要采集足夠量的海水。 

也可以將底泥樣品鋪於無菌培養皿內，25℃～ 28℃自然幹燥 5～7d ，磨碎，80℃或120℃幹熱處理60min。建議用無菌天然海水提取菌體及稀釋，塗布於平板。 

2 鹽、海水對放線菌生長和分離的影響

很多人的實驗證明，海洋放線菌都需要在天然海水或人工海水配製的培養基上才能生長良好。這是設計分離方法及培養基必須考慮的重要因素。 

3 微囊化分離難培養放線菌

海水樣品或底泥經上述處理的稀釋液，用PBS緩衝液 ( pH7.2)將土樣稀釋到終濃度為10細胞／mL。取0.1 ml 細胞懸液與0.5mL預熱(40℃)的瓊脂糖混合。然後將細胞一瓊脂糖混合物也加到 15mL細胞乳化劑中，室溫下2200r／min乳化1min，隨後再在低溫下以2200r／min乳化1min，最後油．菌懸液在低溫下1100r／min邊攪拌邊冷卻6min。這個過程可獲得大約10凝膠微粒。其中大約10％的凝膠微粒含有單個囊化的菌體細胞。單細胞囊化可通過顯微鏡監測。凝膠微粒注入到含有25mL培養基的無菌層析柱中。層析柱中有兩層過濾膜。過濾器可以截流凝膠微粒而使未被囊化的細胞被洗脫，從而防止自由細胞汙染柱中的培養池。培養基按13mL／h速度泵入層析柱中，凝膠微粒在柱中至少培養5周，將微菌落噴灑到 96孔培養盤中(培養基見4節)。通過流式細胞儀可將含有菌落的凝膠微粒與自由細胞分開。分檢的準確性可以通過顯微鏡方法證實。為了確定流式細胞儀可以檢測到的囊化的最小量的細胞。以從液體培養基中獲得的大腸杆菌的一係列梯度 1000,100，and 10為例，細胞按上述的方法分別囊化，稀釋培養液中的細胞通過流式細胞儀可直接計數。囊化的細胞在凝膠微粒中培養3h就形成為菌落，凝膠微粒可用流式細胞儀進行分析。用這種方法可以分離到大量未知菌。

4 培養基

( 1 )M1培養基：澱粉10g，酵母膏4g，蛋白腖2g，瓊脂18g．天然海水定容至1000 mL。 

( 2 )M2培養基：甘油6mL，精氨酸1g，K₂HPO₄  0.5 g，K₂HPO₄  0.5g，MgSO₄0.5g，瓊脂18g，天然海水定容至1000mL 。 

( 3 )M3培養基：葡萄糖6g，幾丁質 2g，瓊脂18 g ，天然海水定容至1000 ml． 

( 4 )M4培養基：幾丁質2g，瓊脂18g，天然海水定容至1000mL．

( 5 )M5培養基：瓊脂18g，天然海水定容至 1000 mL ．

( 6 )幾丁質瓊脂：幾丁質2g，K₂HPO₄ 0.7g，KH₂PO₄ 0.3 g，MgSO₄ 0.5g，瓊脂20g，天然海水定容至1000 mL

( 7 )海藻糖-脯氨酸培養基：海藻糖5g，脯氨酸1g，(NH₄)₂SO₄  1g，NaCl  1g，CaCl₂ 2g，K₂HPO₄  1g，MgSO₄·7H₂O  1g ，複合維生素(維生素B1、核黃素、煙酸、維生素B6 、泛酸鈣、肌醇、P-氨基苯甲酸各0.5mg，生物素0.25mg)，瓊脂20g，天然海水定容至1000 mL 。 

HV培養基的分離效果也較好。 

5   抑製劑

分離海洋放線菌一般都需要使用抑製劑，建議用放線菌酮(100或50mg／1000 mL )或製黴菌素 (100mg／L )加萘啶酮酸(20～25mg／1000mL)。也可以用放線菌酮 ( 100或50mg／1000mL )或製黴菌加利富平5-1Omg／1000mL 。 

參考文獻 [ 略 ]

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