植物組培中褐變的原因及其預防措施

褐變是指在組織培養過程中，培養材料向培養基中釋放褐色物質，致使培養基逐漸變成褐色，培養材料也慢慢變褐而死亡的現象。

很多植物尤其是木本植物體內含有較多的酚類化合物。在完整植物體的細胞中，酚類化合物和多酚氧化酶分隔存在，因此比較穩定。當外植體切割後，切口附近細胞的分割效應被打破，酚類化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌類化合物，醌類化合物又會在酪氨酸酶的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，進一步引起其他酶係統失活，導致組織代謝紊亂，生長受阻，最終逐漸死亡。

（1）植物基因型

在不同植物或同種植物不同基因型的組培過程中，褐變發生的頻率和嚴重程度存在很大的差異，這是由於各種植物所含的單寧及其他酚類化合物的數量不同。一般木本植物的酚類化合物含量比草本植物高，更易發生褐變現象。核桃的單寧含量很高，不僅在接種初期發生褐變，在形成愈傷組織後還會因為褐變而死亡；蘋果進行莖尖培養時，不同品種之間褐變的程度也不一樣。對葡萄的研究也發現類似情況。

（2）外植體的生理狀態

外植體的生理狀態不同，接種後褐變程度不同。一般外植體的老化程度越高，其木質素的含量也越高，也就越容易褐變，成齡材料一般均比幼齡材料褐變嚴重。

另外切口越大，酚類物質的被氧化麵也越大，褐變程度就會更嚴重。因此外植體的受傷程度對褐變的產生具有明顯的影響，傷口加劇褐變的發生。仙客來小葉誘導時，整片葉接種較分成多塊褐變要輕。除機械損傷外，各種消毒劑對外植體的傷害也會引起褐變，對於不易褐變的種類，用升汞消毒後，一般不會引起褐變，若用次氯酸鈉進行消毒，則很容易引起褐變的發生。

（3）取材時間和部位

在不同的生長季節，植物體內酚類化合物含量和多酚氧化酶的活性不同。實驗表明在蘋果和核桃上，冬、春季取材褐變死亡率最低，夏季取材很容易褐變。在取材部位上幼嫩莖尖比其他部位褐變程度低，木質化程度高的節段在進行藥劑消毒處理後褐變現象更為嚴重。

（4）培養基

在初代培養中，培養基中無機鹽濃度過高，會引起酚類物質大量產生，導致褐變。BA和KT不僅促進酚類化合物合成，而且刺激多酚氧化酶的活性，增加褐變；而生長素類如NAA和2，4-D可延緩多酚合成，減輕褐變。采用液體培養基紙橋培養；可使外植體溢出的有毒物質很快擴散到液體培養基中，效果也很好。

（5）光照

在采取外植體前，如果將材料或母株枝條進行遮光處理，然後再切取外植體培養，能夠有效地抑製褐變的發生。將接種後的初代培養材料在黑暗條件下培養，對抑製褐變發生也有一定的效果遮光抑製褐變的原因主要是由於氧化過程中，許多反應受酶係統控製，而酶係統活性受光照影響。但是，暗培養時間過長會降低外植體的生活能力，甚至引起死亡。

（6）溫度

高溫促進酚氧化，培養溫度越高，褐變越嚴重，而低溫可抑製酚類化合物氧化，降低多酚氧化酶的活性，從而減輕褐變。在15-25℃下培養卡特蘭，比在25℃以上時褐變要輕，在17℃以下培養天竺葵莖尖比在17-27℃褐變要輕。

（7）培養時間

材料培養時間過長，會引起褐變物的積累，加重對培養材料的傷害。蝴蝶蘭、香蕉等隨著培養時間的延長，褐變程度會加劇，甚至在超過一定時間不進行轉接，褐變物的積累還會引起培養材料的死亡。

（1）選擇適當的外植體

不同時期和年齡的外植體在培養中褐變的程度不同，選擇適當的外植體是克服褐變的重要手段。避免在夏季高溫季節取材，選擇幼苗、褐變程度輕的品種和部位作為外植體。

（2）外植體預處理

對較易褐變的外植體可采取預處理措施，即先用流水衝洗外植體，然後放置在5℃左右的冰箱中低溫處理12-14h。消毒後先接種到隻含蔗糖的瓊脂培養基中培養3-7d，使組織中的酚類物質部分滲入培養基中，取出外植體用0.1%的漂白粉溶液浸泡10min，然後再接種到合適的培養基上。

（3）篩選合適的培養基和培養條件

降低鹽濃度，減少BA和KT的使用，采取液體培養，初期黑暗或弱光條件下培養，保持較低溫度（15-20℃）也是降低褐變的有效方法。

（4）添加抗氧化劑和係縛劑

在培養基中添加抗氧化劑，或用抗氧化劑進行材料的預處理或預培養，可預防醌類物質的形成，對易褐變材料的培養有很好的輔助作用。常用的抗氧化劑有抗壞血酸、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、硫代硫蛋白等。添加1-5g/L的活性炭對酚類物質的吸附效果也很明顯。

（5）連續轉移

對易發生褐變的植物，在外植體接種後1-2d立即轉移到新鮮培養基上,可減輕酚類物質對培養物的毒害作用,連續轉移5-6次可基本解決外植體的褐變問題。