植物組培中愈傷組織的培養

在植物組織培養過程，植物的細胞、組織、器官等均可作為外植體進行離體培養。依據外植體來源的不同，植物組織培養可分為愈傷組織培養、器官培養、花藥和花粉培養、胚培養、細胞培養、原生質體培養。

 

 

愈傷組織是指在形態上沒有分化但能進行活躍分裂的細胞團，細胞分裂疏鬆無序或較為緊密。在自然狀態下，當植物體的一部分受到機械損傷、昆蟲咬傷或風雪等自然災害的襲擊後，能夠在傷口處形成疑團愈傷組織，起到修複和保護作用。在離體培養條件下，許多植物的外植體也會出現類似情況，在外植體切口處及其附近形成愈傷組織，所不同的是離體培養條件下產生的愈傷組織細胞具有再分化的潛力，即細胞能夠分裂、增殖和分化出不同形態、執行不同功能的組織和器官。

愈傷組織培養技術是植物組織培養中一項很重要的技術，絕大多數植物在培養時都要先經過愈傷組織階段，再進行形態發生過程。主要應用於研究植物生長發育及分化機製、遺傳變異規律；還可用於大規模工廠化生產有用化合物，或作為原生質體培養材料來源等。

 

從培養的植物材料獲得愈傷組織，大致可分為誘導、分裂和分化3個階段。

用於誘導愈傷組織的植物材料是由已經分化的成熟植物細胞組成，如葉片是由表皮、葉肉和葉脈3部分組成，其構成的各種類型細胞均為已經分化的成熟細胞，大部分已經喪失了分生能力，不能進行細胞分裂。根據植物細胞全能性理論，即使是已高度成熟和分化的植物細胞，也還保持著恢複到分生狀態的能力。

植物愈傷組織培養是利用特定的條件，促進細胞脫分化，使原已分化並具有一定功能的細胞脫離原有發育方向，失去原有狀態和功能，而恢複到未分化的愈傷組織狀態，這就是脫分化過程。實現此過程可通過在培養基中添加植物生長調節劑，促使已分化的細胞改變原有代謝途徑，為重新啟動細胞分裂做準備。

誘導階段的長短取決於該細胞原來的生理狀態、培養基中植物生長調節劑的種類、含量和相對比例以及培養條件的因素。如菊芋的誘導期隻需1d，胡蘿卜的誘導期則需要幾天時間。一般培養材料細胞的分化程度愈高或愈成熟，進行脫分化誘導也就愈加困難，需要的時間也就越長。在誘導期，通過一些刺激因素和植物生長調節劑的誘導作用，使其合成代謝活化，細胞內的合成代謝迅速進行，但是細胞的大小並沒有多大改變。

外源植物生長調節劑對誘導細胞分裂效果最好，其在植物愈傷組織培養中得到廣泛的應用。因此，依據實際情況，可通過調整生長調節劑的種類和濃度來誘導細胞進行分裂。經過誘導的植物細胞在內部生理上將發生顯著的變化，如細胞質增加、出現活躍的原生質環流、儲藏物質澱粉等消失，蛋白質和核酸的含量增加，為啟動細胞分裂做準備。

分裂期是指細胞通過分裂方式，不斷增生子細胞的過程。對一些植物來說，誘導細胞分裂和使細胞保持分裂能力可能需要相同的條件，即在同一條件下就可完成細胞脫分化全過程。但也有一些植物在完成短時間誘導後，需要改變培養基成分和培養條件，否則隻能見到少量愈傷組織或或完全沒有肉眼可見的變化。一般來說，誘導階段需要較高濃度的生長素和細胞分裂素，細胞分裂階段則要適當降低植物生長調節劑的濃度。植物細胞一經誘導，其外層細胞完成脫分化過程，細胞開始迅速分裂。在細胞體積變小，內無液泡，細胞核和核仁增至最大，RNA含量持續上升等。培養物的形態變化表現為外層細胞分裂迅速。

分裂期愈傷組織的特征：細胞分裂快，結構疏鬆，缺少有組織的結構，顏色淺而透明。如果在原培養基上繼續培養，細胞將不可避免地發生分化，產生新的結構，但把組織塊及時轉移到新鮮的培養基上，則愈傷組織可無限製地維持在不分化的增殖狀態。

外植體的脫分化因植物種類和器官及其生理狀況而有很大差異，如煙草、胡蘿卜等脫分化較容易，而禾穀類植物的脫分化較困難；花器脫分化較易，而莖、葉較難；幼嫩組織脫分化較易，而成熟的老組織較難。

分化期是指停止分裂的細胞發生生理代謝變化，出現形態和功能各異細胞的時期，其主要形態變化如下：

（1）細胞分裂部位和方向發生變化。分裂期細胞主要進行平周分裂（局限於組織外緣並於組織周緣平行的分裂），而在分化期開始後，愈傷組織表層細胞的分裂逐漸減慢，並停止。轉變為愈傷組織內部深處的局部區域的細胞分裂，使分裂麵的方向改變，出現了由分生組織構成的“瘤狀結構”。

（2）形成分生組織瘤狀結構和維管組織。迅速生長的愈傷組織是類似的，處於分化期的愈傷組織會形成由分生組織組成的瘤狀結構，它們往往變成不再進一步分化的生長中心，而從其周緣產生擴展的薄壁細胞，其結果使一個活躍生長的愈傷組織形成一種“泡狀”增殖的特征。在愈傷組織中，可形成維管組織，但通常並不形成維管係統，而是呈分散的節狀和短束狀結構，它可由木質部組成，或由木質部、韌皮部形成層組成。在所有生長調節劑中細胞分裂素對木質部誘導作用比較明顯。

（3）細胞的形態大小保持相對穩定，體積不再減小，愈傷組織不再增殖。

（4）出現了各種類型的細胞，如管胞、篩胞、薄壁細胞、石細胞、色素細胞等。

 

在植物材料培養過程中，植物細胞經過脫分化過程和持續的細胞分裂而形成愈傷組織。在愈傷組織中形成一些分生細胞團，隨後再分化出各種器官原基，甚至體細胞胚，進而發育成苗或完整植株。

愈傷組織培養中器官發生分為3個不同階段：

（1）細胞增殖或離體外植體脫分化形成愈傷組織

（2）愈傷組織中形成一些分生細胞和瘤狀結構

（3）在一定條件下，分生細胞逐漸轉變成為縱軸上表現出單向極性器官原基，即分化出芽和根。

在植物組織培養中，當外植體形成愈傷組織後，可通過調整植物生長劑比例促使芽和根的分化。一般來說，生長素有利於愈傷組織形成根，細胞分裂素可促進愈傷組織形成芽。愈傷組織的器官發生順序有4種情況：

①     愈傷組織僅僅有芽或根器官的分別形成

②     芽形成後，在其莖基部長出根而形成小植株

③     先形成根，再從根的基部分化出芽形成小植株

④     在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然後兩者結合起來形成一株小植株

植物的體細胞在一定條件下誘導形成的類似合子胚的結構稱為體細胞，也稱胚狀體。在離體條件下，培養細胞經脫分化後，發生持續細胞分裂增殖，並順次經過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，最終形成具有胚芽、胚根、胚軸的胚狀結構，進而長成完整植株。

細胞經由胚狀體方式形成完整植株，與不定芽和根的發生相比，有以下3個特征：

①     具有兩極性

②     胚狀體與外植體維管組織之間無直接聯係

③     胚狀體維管組織分布呈“Y”形。