植物的器官培養

植物器官培養主要是指對植物的根、莖、葉等器官進行的離體培養。植物器官培養取得成功的事例很多，應用的範圍也很廣，是植物組織培養中最重要的方麵之一。在生產上，植物器官培養具有極其重要的應用價值。首先，通過離體器官培養開發的植物快速繁殖技術，可在短期內提高繁殖效率，加速優良品種和名貴品種的繁殖速度。其次，利用莖尖培養可以得到脫毒的試管苗，解決馬鈴薯、甘薯、草莓等一些植物品種的退化問題，提高作物的產量和品質。此外，還可將植物器官進行誘變處理，利用器官培養得到突變株，進行細胞突變育種。在理論上，利用器官培養研究器官的功能及器官之間的相關性、器官的分化及形態建成等問題，有助於我們認識植物生命活動的規律，控製植物的生長發育，更好地為生產服務。

由於植物器官的種類不同，所采用的培養方法、培養條件也不一樣。對植物器官進行離體培養時，除莖尖能夠繼續生長外，一般要經過脫分化過程，即首先要經過愈傷組織階段，再在愈傷組織中，形成分生細胞團，隨後分化出器官原基，最終培養形成完整植株。

離體根培養是研究根係生理代謝、器官分化、形態建成的優良實驗體係。由於根具有生長速度快、代謝旺盛、變異性小、離體培養時不受微生物的幹擾等特點，能夠根據研究需要，通過改變培養基的成分來研究其營養吸收、生長和代謝的變化規律。在生產上，通過建立快速生長的根無性繁殖係，可以進行一些重要藥物的生產。有些化合物隻能在根中合成，必須用離體根培養的方法，才能生產該化合物。此外對根細胞培養物進行誘變處理，可篩選出突變體，從而應用於育種實踐。

首先將植物種子進行表麵消毒，在無菌條件下萌發，待根伸長後切取長0.5~1.5cm的根尖接種於預先配製好的培養基中。一般根的培養物生長很快，幾天後就能發出側根，可切下進行培養，如此反複，就可得到由單個根尖形成的離體根無性係。培養時一般采用100ml三角瓶，內裝40~50ml培養液。如果對離體根進行較長時間的培養觀察，就要采用大型器皿，可采用500~1000ml三角瓶進行培養。根據需要可在瓶中添加新鮮培養液繼續培養或將根進行分割轉移進行繼代培養。采用營養液流動培養的方法可防止培養過程中培養基成分變化對生長帶來一些影響。

①基本培養基

離體根培養時一般選擇無機鹽濃度低的White培養基，也可以采用MS、B5等培養基，但必須將其濃度稀釋到2/3或1/2。

②基因型

不同種類植物的根對培養的反應不同，如番茄、馬鈴薯、煙草、小麥等植物的離體根能快速生長，並產生大量健壯的側根，可進行繼代培養而無限生長；蘿卜、向日葵、蕎麥、豌豆等植物的離體根需較長時間培養，但久之會失去生長能力；一些木本植物的離體根則很難生長。

③營養條件

離體根生長要求培養基中應具備植物生長所需的全部必要元素。在適合的pH條件下，大量元素中硝酸銨是一種理想的氮源。微量元素對離體根的培養影響也很大，如缺硫會使離體根生長停滯；缺乏其他微量元素同樣會影響到離體根的生長。蔗糖是雙子葉植物離體根培養最好碳源，其次是葡萄糖和果糖。在有些植物中蔗糖的效果甚至比葡萄糖高10倍。在番茄培養時鹽酸硫胺素是不能缺少的，否則番茄根的生長將立即停止，在適當的濃度內，它對生長的促進作用與濃度成正比。

④植物生長調節劑

不同植物離體根對生長調節劑的反應有一定的差異，如在櫻桃、番茄等的培養過程中，生長素抑製離體根的生長；而在歐洲赤鬆、矮豌豆、玉米和小麥培養時，生長素促進離體根的生長；黑麥和小麥等一些變種離體根的生長依賴於生長素的作用。GA3能明顯影響側根的發生和生長，加速根組織的老化；KT則能增加根分生組織的活性，有抗老化的作用。

此外其他條件改變也會影響到生長調節劑的作用，如在低濃度蔗糖（1.5%）條件下，KT對番茄離體根的生長有抑製作用，這是由分生取細胞分裂速度降低造成的，與此相反，在高濃度蔗糖（3%）條件下KT能夠刺激根的生長。另外，KT能夠延長離體根分生組織的活性，起著抗老化的作用，並能與外加GA3和NAA的反應相拮抗，因此，生長調節劑的作用表現出一定複雜性。

⑤pH

在番茄的離體根培養中,采用單一硝態氮源時,培養液pH應為5.2，而當用單一銨態氮源時，pH在7.2為宜。在培養過程中pH的改變會影響到鐵鹽的吸收，進而影響番茄根的生長速度。使用非螯合態的鐵，當pH升高至6.2時，鐵鹽失效，造成培養液中缺鐵。使用Fe-EDTA時，pH為7時，也不會感到缺鐵。一般可采用Ca(H2PO4)2或CaCO3作為緩衝劑，以獲得穩定的pH。

⑥光照和溫度

離體根培養溫度以25-27℃為佳，一般情況下離體根均進行暗培養，但也有些植物光照能夠促進其根係生長。

 

莖尖培養是切取莖的頂端部分或莖的分生組織進行無菌培養。莖尖是植物組織培養中最常用的材料之一，依莖尖大小和目的可將其分為莖尖分生組織培養和普通莖尖培養兩種類型。莖尖分生組織培養的目的是獲得脫病毒植株，要求切取帶有1~2個葉原基，大小為0.1~1.0mm的莖尖。普通莖尖培養主要用於植物快速繁殖，莖尖大小為幾毫米到幾十毫米。此外，莖尖培養還用於品種改良和基礎理論研究等方麵。

普通莖尖培養進行植物快速繁殖已成為一項較為成熟的技術。由於該技術是在無菌條件下，在較短的時間和較小的空間內，將一個微型個體進行大量繁殖的方法。因此，人們把這種繁殖技術又稱為微繁技術。

莖尖培養過程一般包括4個階段：無菌培養的建立、中間繁殖體的增殖、誘導生根和試管苗的移栽。

①無菌培養的建立

a、取材。

一般來說首選的外植體材料是正在生長的頂芽或側芽，但一些植物的莖段、鱗莖、塊莖、球莖、花莖等同樣可以作為快速繁殖的材料，他們可以通過培養產生不定芽而進行繁殖。

b、消毒。

由於植物的種類及材料的來源不同，可采取不同的消毒方法。首先對材料進行流水衝洗，再用70%酒精漂洗幾到十幾秒鍾，然後用0.1%升汞消毒，消毒時間一般在5~8min，對於來自較老枝條上的頂芽和側芽及有芽鱗片保護的芽消毒時間可長達8~12min，消毒後的材料用無菌水洗3~5次。

c、切取莖尖。

在無菌條件下對植物材料進行常規剝離，將剝離的莖尖及時轉入到適當的培養基中培養。一般用於快速繁殖的莖尖材料，比用於脫毒的莖尖組織要大，可帶2~4個葉原基或更多。

d、培養基。

目前用於快速繁殖的基本培養基有MS、B5、White等。培養基中B族維生素是維持快速生長所必要的成分，水解乳蛋白或水解酪蛋白有利於許多植物不定芽和不定胚的分化。培養基中生長素與細胞分裂素的比例影響器官發生的方向，植物種類、部位、季節不同，對於植物生長調節劑的反應也不一樣。為了使莖尖順利地發育成健壯完整的植株，重點是生長調節劑的水平。在進行莖尖微繁時，使用3種類型的生長調節劑：第一類是生長素，用得最多的是NAA，其次是IAA；第二類是細胞分裂素，如6-BA、KT，細胞分裂素在促進不定芽產生上效果顯著；第三類是GA3，它往往有利於莖尖的伸長和成活，需要的濃度較低，一般為0.1mg/L，濃度太高會產生不利影響。

e、培養條件。

一般光照強度為1000~3000lx，光周期使用連續光照或16h光照8h黑暗。光照不是為了滿足培養物光合作用的需要，而是用於植物的光形態建成。培養溫度通常在25℃左右，但因植物種類不同，有時也采用較低或較高的溫度。在幹燥的季節還應注意培養室內濕度的管理，以防培養基內的水分散失過多對培養不利。

②繼代培養

為了增加培養物的數量，必須進一步繁殖，使之越來越多。增長使用的培養基對同一材料來說，每次幾乎都是相同的。由於培養材料在最適宜的條件下培養，排除了其他生物的競爭，就能夠按幾何級數增殖。經過連續不斷的繼代培養，達到應繁殖的數量後，再進入下一階段進行壯苗和生根。

③生根培養

礦質元素濃度高時有利於發展莖葉，較低時有利於生根，因此，生根培養一般選用無機鹽濃度較低的培養基作為基本培養基。MS培養基無機鹽濃度較高，在生根時多采用1/2MS或1/4MS。一般生根培養基中要完全去除或僅用很低濃度的細胞分裂素，並加入適量的生長素，如NAA、IBA等。生根培養基中的糖濃度要降低到1..0%~1.5%，以促使植株增強自養能力，同時降低培養基的滲透勢，有利於完整植株的形成和生長。

 

①基因型

不同科、屬植物要求的條件有很大差別，甚至同一屬的不同種間以及品種間，其表現也不一樣。但也有另一些情況，即在分類地位相距甚遠的若幹種植物中，可能恰好可以用完全相同的培養基。

②外植體的大小

培養莖尖材料過大，不利於叢生芽與不定芽的形成，另外，外植體越大也越容易被汙染。但外植體也不要太小，非常小的外植體其存活率很低。

③材料的生理狀態

一般以春天芽已經膨大，但芽鱗片還沒有張開時最為合適。此時，芽生長旺盛，並有芽鱗片保護，裏麵是無菌的。對於某些需要高溫和低溫處理或特殊光周期處理才可以打破休眠的塊莖、鱗莖、球莖等，常常要處理以後才能剝取莖尖進行培養。

④芽在植株上的部位

對於草本植物來說，使用頂芽或上部的芽，常常比用側芽或基部的芽容易培養。這可能與它們生長較為旺盛有關，但由於頂芽的數量有限，也常用側芽作為培養材料。芽在植株上的部位對莖尖培養的影響因不同的植物種類而異，不可一概而論。例如月季等枝條中間部位的芽成活率高，對培養基反應好。

⑤供試植株的年齡

多年生木本植物隨著年齡的增加，分生組織、莖尖和芽的培養變得越困難，成年樹較幼態樹的培養要困難的多。一年生或多年生草本植物，營養生長早期的頂芽、腋芽比營養生長後期的頂芽與腋芽的培養要容易的多。

⑥培養基

生長調節劑是影響莖尖培養的主要因子。不同的基本培養基對莖尖的培養也有一定的影響。因此，在進行莖尖培養研究中，篩選適宜於某品種微繁殖的基本培養基也是非常重要的。

⑦環境條件

在培養的起始期和莖芽的增殖期，光照可滿足植物的形態建成過程的需要。在生根階段適當增加光照可使小植株具有進行光合作用的能力，由異樣型過渡到自養型，並使植株堅韌，提高抗逆性，提高移栽成活率。

 

 

葉的培養是對葉原基、子葉、葉的組成部分等葉組織進行的離體培養。葉是植物進行光合作用的器官，也是某些植物的繁殖器官。離體葉培養主要用於研究葉形態建成、光合作用、葉綠素形成等理論問題；也可利用離體葉組織建立植物體細胞迅速無性繁殖係，提高某些不易繁殖植物的繁殖係數。此外，葉細胞培養物是良好的遺傳誘變係統，經過自然變異或者人工誘變處理可篩選出突變體在育種實踐中加以應用。

①取材與消毒

選取植物的葉原基、葉片或葉柄等，經流水衝洗幹淨，經70%酒精消毒後，用0.1%升汞消毒5~8min，一般幼嫩葉的消毒時間宜短些，再用無菌水衝洗3~5次。消毒後的葉片轉入到鋪有濾紙的無菌培養皿內，用解剖刀切成5mm*5mm左右的小塊，然後上表皮朝上接種於固定培養基上。

②培養

葉培養常用的有MS、B5、White、N6等基本培養基。附加物中碳源一般都使用蔗糖，濃度為3%左右。生長調節劑是影響葉組織脫分化和再分化的主要因素，對大多數雙子葉植物的葉來說，培養中細胞分離素特別是KT和BA有利於芽的形成，而生長素有利於根的發生，添加2，4-D有利於愈傷組織的形成。此外，還需添加椰子汁等有機添加物，以利於葉組織中的形態發生。

葉組織一般在25~28℃條件下培養，光照12~14h/d，光照強度為1500~2000lx，不定芽分化和生長期應將光照強度增加到3000~10000lx。

①基因型

不同的植物種類在葉組織培養特征上有一定的差異，同一個物種的不同品種間葉組織培養特性也不盡相同。

②植物生長調節劑

植物生長調節劑在植物葉組織培養中起著重要作用，葉組織一般要經過愈傷組織階段，即經過脫分化與再分化過程。其器官形成符合生長調節劑比例控製器官發育模式。例如許智宏（1986）在煙草葉片培養中發現，低濃度NAA與不同濃度的BA配合或BA單獨使用均能形成大量的芽，以含有NAA者莖葉生長較好，且很少有根的形成，反之則明顯地促進根和愈傷組織的形成。

③植株的葉齡

一般個體發育早期的幼嫩葉片較成熟幼嫩葉片分化能力高。

④其他因素

極性也是影響某些植物葉組織培養的一個較為重要的因素。煙草一些品種離體葉片若將背葉麵朝上放置時，就不生長、死亡或隻形成愈傷組織而沒有器官的分化。

對離體葉片進行的損傷有利於愈傷組織的形成。大量的葉片組織培養證明，大多數植物愈傷組織首先在切口處形成，或切口處直接產生芽苗的分化。但是，損傷引起的細胞分裂活動並非上誘導愈傷組織和器官發生的唯一動力。一些植物（如秋海棠）還可以從沒有損傷的離體葉組織表麵大量發生。

①外植體直接產生不定芽

葉組織離體培養後，由離體葉片切口處組織迅速愈合並產生瘤狀突起，進而產生大量的不定芽；或由離體葉麵表皮下柵欄組織直接脫分化，形成分生細胞，進而分裂成分生細胞團，產生不定芽。

②經由愈傷組織產生不定芽

葉組織離體培養後，首先由離體葉片組織脫分化形成愈傷組織，然後由愈傷組織再分化出不定芽；或者脫分化形成的愈傷組織經繼代後誘導不定芽的分化。